【摘要】：第一部分2型糖尿病對于大鼠骨折愈合影響的研究目的:通過給予SD大鼠高脂飼料喂養(yǎng),并腹腔注射低劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)來建立2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)動物模型,并在此基礎上建立右側股骨干閉合性骨折動物模型,以此模型為基礎對其骨折后第2、3周時骨折端愈合情況進行分析,研究T2DM對于骨折愈合的影響。方法:1.32只健康雌性(Sprague-Dawley,SD)大鼠,2月齡,所有實驗大鼠被隨機分為2組(n=16):骨折對照組(control fracture,CF),2型糖尿病骨折組(T2DM+fracture,DF)。2.大鼠在骨折第2、3周行X線檢查后被處死并取材。檢測其血清內各生化指標;利用番紅O-固綠染色,分析骨痂內骨性、軟骨性和纖維性骨痂所占骨痂總面積的比值;對骨痂內VEGF和α-SMA進行免疫組織化學染色,依次分析骨痂內VEGF的表達強度和血管密度。結果:1.T2DM模型建立后,實驗過程中DF組血糖值顯著高于CF組,T-CHO和TG濃度于骨折后第2、3周均顯著高于CF組(P0.05)。2.骨折后的第2、3周,DF組大鼠骨折愈合X線評分均顯著低于CF組(P0.05)。3.分析番紅O-固綠染色結果顯示,在骨折后第2周時,DF組骨性和軟骨性骨痂的面積比均顯著低于CF組(P0.05),但其纖維性骨痂的面積比卻顯著高于CF組(P0.05)。在骨折后第3周時,DF組骨性骨痂的面積比仍顯著低于CF組(P0.05),其纖維性骨痂的面積比仍顯著高于CF組(P0.05),但兩組間軟骨性骨痂的面積比無顯著差異。4.骨折后第2周時,DF組骨痂中VEGF的表達量和血管密度均顯著低于CF組(P0.05),第3周時,CF組和DF組骨痂中VEGF的表達量無明顯差異。DF組骨痂中的血管密度顯著高于CF組(P0.05)。第二部分雙側卵巢切除對2型糖尿病大鼠骨折愈合影響的研究目的:在建立T2DM動物模型的同時,切除大鼠雙側卵巢致其骨質疏松,并在此基礎上建立右股骨干閉合性骨折模型,以研究此動物模型對于骨折愈合的影響。方法:1.48只健康雌性SD大鼠,2月齡,實驗大鼠被隨機分為3組(n=16):骨折對照組(control fracture,CF),2型糖尿病骨折組(T2DM+fracture,DF)、2型糖尿病并骨質疏松骨折組(T2DM+Osteoporosis Fracture,DOF)。2大鼠在骨折第2、3周行X線檢查后被處死并取材。標本行Micro-CT檢測后,骨組織徹底脫鈣,利用馬松(Masson)染色分析骨痂內骨性和軟骨性骨痂所占骨痂總面積的比值;利用免疫組織化學染色方法,分析骨痂中ColⅡ和Caspase-3的表達情況。結果:1 T2DM模型成功建立后,DF組、DOF組大鼠血糖均明顯高于CF組。2通過X線片測量骨痂面積結果顯示,骨折后第2周時,DF組和DOF組的骨痂面積均顯著小于CF組(P0.05),DOF組顯著小于DF組(P0.05);骨折后3周時,CF組、DF組和DOF組之間無顯著差異。3 Micro-CT檢測顯示,在骨折后第2周時,DOF組Tb.N顯著低于CF組和DF組(P0.05),CF組和DF組之間無顯著差異;DF組和DOF組Tb.Th均顯著低于CF組(P0.05),DF組和DOF組之間無顯著差異;DOF組Tb.Sp顯著高于CF組和DF組(P0.05),CF組和DF組之間無顯著差異。在骨折后第3周時,DF組和DOF組Tb.N均顯著低于CF組(P0.05),DOF組顯著低于DF組(P0.05);DF組和DOF組Tb.Th顯著低于CF組(P0.05),DF組和DOF組之間無顯著差異;DF組和DOF組Tb.Sp顯著高于CF組(P0.05),DOF組顯著高于DF組(P0.05)。4分析Masson染色結果顯示,在骨折后第2周時,DF組和DOF組骨性和軟骨性骨痂面積比均明顯小于CF組(P0.05),DOF組骨性骨痂面積比與DF組無顯著差異,DOF組軟骨性骨痂面積比明顯小于DF組(P0.05);骨折后的第3周時,DF組和DOF組骨性骨痂面積比均明顯小于CF組(P0.05),DOF組明顯小于DF組(P0.05),CF、DF和DOF三組間軟骨性骨痂面積比無顯著差異。5分析ColⅡ在骨折端骨痂內的表達顯示,在骨折后第2周時,DF組和DOF組ColⅡ的表達均要顯著低于CF組(P0.05),DOF組顯著低于DF組(P0.05);在骨折后第3周時,DOF組ColⅡ的表達顯著低于CF組和DF組(P0.05),CF組和DF組之間無顯著差異。分析Caspase-3在骨折端骨痂內的表達顯示,在骨折后第2周時,DF組和DOF組Caspase-3的表達均顯著高于CF組(P0.05),DOF組顯著高于DF組(P0.05);第3周時,DF組和DOF組Caspase-3的表達均顯著高于CF組(P0.05),DOF組與DF組之間無明顯差異(P0.05)。第三部分雷奈酸鍶聯(lián)合胰島素對雙側卵巢切除2型糖尿病大鼠骨折愈合的影響目的:以2型糖尿病并雙側卵巢切除股骨閉合性骨折大鼠模型為基礎,研究單獨應用胰島素或聯(lián)合雷奈酸鍶治療對于其骨折愈合的影響。方法:1 80只健康雌性SD大鼠,2月齡,所有實驗大鼠被隨機分為5組(n=16):骨折對照組(control fracture,CF)、2型糖尿病骨折組(T2DM+fracture,DF)、2型糖尿病并骨質疏松骨折組(T2DM+Osteoporosis Fracture,DOF)、胰島素干預組(T2DM+Osteoporosis+Fracture+Insulin,DOFI)和胰島素聯(lián)合雷奈酸鍶干預組(T2DM+Osteoporosis+Fracture+Insulin+Strontium ranelate,DOFIS)。2大鼠在骨折第2、3周行X線檢查后被處死并取材。行Micro-CT檢測后,骨組織徹底脫鈣,利用番紅O-固綠染色分析骨痂內骨性和軟骨性骨痂所占骨痂總面積的比值;利用TRAP染色,分析單位骨痂面積內破骨細胞的數(shù)量;并利用免疫組織化學方法分析OCN、ColⅠ在骨痂內的表達情況。結果:1.T2DM模型建立后,DF組、DOF組、DOFI組及DOFIS組血糖均明顯高于CF組,給予胰島素干預后,DOFI組及DOFIS組血糖值趨于正常水平,并控制平穩(wěn)。2.骨折后2周時,DF組和DOF組的骨折愈合X線評分均明顯低于CF組(P0.05),DF組和DOF組之間無顯著差異,DOF組、DOFI組及DOFIS組之間無顯著差異;骨折后3周時,CF組、DF組、DOFI組及DOFIS組骨折愈合X線評分均顯著高于DOF組(P0.05),CF組顯著高于DF組(P0.05),而DOFI組及DOFIS組之間無顯著差異。3.Micro-CT檢測顯示,在骨折后第2周時,DF組和DOF組BMD、BV,TV和BV/TV均明顯低于CF組(P0.05),DOF組BV,TV和BV/TV顯著低于DF組(P0.05),DF組和DOF組之間BMD無顯著差異;在骨折后第3周時,DF組和DOF組BMD、BV和BV/TV均明顯低于CF組(P0.05),DOF組BMD、BV和BV/TV均明顯低于DF組(P0.05),CF、DF組和DOF組三組間TV無顯著差異。在骨折后第2周時,DOF組、DOFI組和DOFIS組之間BMD無顯著差異,DOFI組和DOFIS組BV,TV和BV/TV顯著高于DOF組(P0.05),DOFI組和DOFIS組之間無顯著差異;在骨折后第3周時,DOF組、DOFI組和DOFIS組之間TV無顯著差異,DOFI組和DOFIS組BMD、BV和BV/TV均顯著高于DOF組(P0.05),但DOFI組和DOFIS組之間無顯著差異。4.分析番紅O-固綠染色結果可見,在骨折后第2周時,DF組和DOF組骨性骨痂面積比均明顯小于CF組(P0.05),DF組和DOF組之間無顯著差異,DOF組、DOFI組和DOFIS組之間無顯著差異;在骨折后第3周時,DF組和DOF組骨性骨痂面積比均明顯小于CF組(P0.05),DOF組明顯小于DF組(P0.05),DOFI組和DOFIS組明顯大于DOF組(P0.05),DOFI組和DOFIS組之間無顯著差異。在骨折后第2周時,DF組和DOF組軟骨性骨痂面積比均明顯小于CF組(P0.05),DOF組明顯小于DF組(P0.05),DOFI組和DOFIS組明顯大于DOF組(P0.05),DOFI組和DOFIS組之間無顯著差異;在骨折后第3周時,各組間軟骨性骨痂面積比均無顯著差異。5.分析骨痂內TRAP染色結果可見,在骨折后第2、3周,DF組和DOF組單位骨痂面積內TRAP染色陽性的破骨細胞數(shù)量均明顯高于CF組(P0.05),DOF組明顯高于DF組(P0.05);在第2周時,DOF組、DOFI組和DOFIS組之間單位骨痂面積內TRAP染色陽性的破骨細胞數(shù)量無明顯差異,在第3周時,DOFI組和DOFIS組單位骨痂面積內TRAP染色陽性的破骨細胞數(shù)量明顯低于DOF組(P0.05),DOFIS組明顯低于DOFI組(P0.05)。6.分析免疫組化結果可見,在骨折后第2周時,DF組和DOF組OCN、Col I的表達均顯著低于CF組(P0.05),DF組和DOF組之間無明顯差異;在骨折后第3周時,DF組和DOF組OCN、Col I的表達均顯著低于CF組(P0.05),DOF組顯著低于DF組(P0.05)。在骨折后第2周時,DOFIS組OCN、Col I的表達均顯著高于DOF組和DOFI組(P0.05),DOF組和DOFI組之間無明顯差異;在骨折后第3周時,DOFI組和DOFIS組OCN、Col I的表達均顯著高于DOF組(P0.05),DOFI組和DOFIS組之間OCN的表達無顯著差異,DOFIS組Col I的表達顯著高于DOFI組(P0.05)。結論:1.應用高脂飼料飲食聯(lián)合低劑量STZ注射可以成功建立T2DM動物模型,且此動物模型符合人類T2DM發(fā)病特點;采用骨組織影像學、組織形態(tài)學和免疫組織化學方法分析后發(fā)現(xiàn),T2DM對于骨折愈合早期階段骨痂內的血管生成有明顯的抑制作用,這可能是其骨折愈合發(fā)生延遲的重要原因。2.在T2DM動物模型基礎上行雙側卵巢切除術,可使其骨折愈合早期階段的骨痂面積明顯縮小,骨痂內新生骨質的空間微結構進一步損害,骨折愈合發(fā)生延遲,這可能與其增加骨痂內軟骨細胞凋亡,抑制其軟骨內成骨過程有關。3.單獨胰島素治療可促進雙側卵巢切除T2DM大鼠骨折愈合進程,改善其骨折端骨痂內的骨量及微結構,而其促進骨形成和抑制骨吸收的作用可能是此結果的重要原因;在此基礎上,聯(lián)合應用雷奈酸鍶干預,雖然表現(xiàn)出可進一步促進骨形成和抑制骨吸收的作用,但是在本實驗周期及藥物劑量的前提下,其對于骨折愈合過程和骨痂內的骨量及微結構并沒有明顯的改善。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R587.2;R580
【圖文】：

動物自由飲食。所有實驗大鼠被隨機分為2組（n=16）：骨折對照組（controlfracture, CF），2型糖尿病骨折組（T2DM+fracture, DF）。（實驗流程見圖1）圖1 實驗流程Fig.1 Experimental Procedures. Note: Lines: Rats in the CF group were fed anormal chow diet. Dotted lines: Rats in the experimental groups were fed ahigh-fat diet. STZ: the streptozotocin solution was injected intraperitoneally inDF group at 3 weeks. : Establish an animal model of fracture. :Animals were sacrificed.2.2 動物處理1) 在整個實驗周期中，CF組大鼠給予普通大鼠飼料進行喂養(yǎng)，DF組

23圖2 右側股骨干閉合性骨折動物模型建立Fig.2 Establishment of animal model of right femoral shaft closed fracture.Note: A: Disinfection; B: Incision; C: Exposing the trochlea; D: Reaming; E:Internal fixation needle; F: Inserting the needle; G: Hammering the needle intobone; H: Suture; I: Closed fracture caused by impact.4) 術后為了預防手術傷口感染，給予大鼠肌肉注射慶大霉素3天。5) 術后即刻對大鼠右側股骨干全長進行X線檢查，確認股骨干閉合性骨折模型建立成功與否，并留存X線片。6) 密切觀察術后大鼠身體狀況及術側后肢的日�；顒忧闆r。7）實驗動物被隨機平均分為兩批，分別在骨折模型造模成功后的第2、3周，以40mg/kg給予大鼠3%戊巴比妥鈉腹腔注射行麻醉后，行右側股骨干全長X線檢查，參照Chueng KM[33]和Wong E[34]的描述

2. 血清學指標2型糖尿病動物模型建立后，DF組血糖值于各時間點均顯著高于CF組（圖3），DF組大鼠血中總膽固醇（T-CHO）、甘油三酯（TG）濃度于骨折模型建立后2周、3周均顯著高于CF組（P < 0.05）（圖4，表1）。圖3 兩組大鼠血糖變化趨勢Fig.3 Blood glucose changes of the two groups

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