【摘要】：目的:碘是人體所必需微量元素之一,但人體碘攝入過量會導(dǎo)致許多疾病。大量的研究表明,攝入高碘可損害甲狀腺的結(jié)構(gòu)和功能,引發(fā)很多甲狀腺疾病。近年來,高碘對智力的不利影響正受到越來越多的關(guān)注,但高碘與神經(jīng)毒性之間的關(guān)系存在爭議。本研究通過模擬人群高碘暴露方式構(gòu)建的大鼠高碘飲水染毒模型探討高碘攝入是否會導(dǎo)致神經(jīng)毒性及凋亡和自噬在其中的作用。方法:選擇36只健康成年SPF級Sprague-Dawley(SD)大鼠,雌雄比為2:1,體重210~250 g。各性別的大鼠被隨機(jī)分成4組:1個對照(自來水)組和3個碘酸鉀(Potassium iodate,KIO_3)染毒組(500、2 500、5 000μg/L KIO_3)。大鼠自由飲水進(jìn)食。將各組大鼠按雌雄比2:1合籠配對,將孕鼠放置在單獨(dú)的籠子中,并保持染毒方式和劑量不變至仔鼠斷乳(出生后第21天)。斷乳后將親代和子代分開,從每組隨機(jī)挑選10只雌性仔鼠,保持染毒方式和劑量不變至仔鼠出生后第4個月末。定期記錄大鼠的體重。應(yīng)用砷鈰催化分光光度法檢測4月齡雌鼠尿碘濃度,應(yīng)用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)(MWM)檢測4月齡雌鼠的學(xué)習(xí)能力和記憶能力,應(yīng)用尼氏染色(Nissl staining)檢測4月齡雌鼠的海馬組織病理結(jié)構(gòu)變化,應(yīng)用透射電子顯微鏡(TEM)檢測4月齡雌鼠海馬組織超微結(jié)構(gòu)的變化,應(yīng)用檢測DNA斷裂碎片的原位末端標(biāo)記實(shí)驗(yàn)(TUNEL)檢測4月齡雌鼠海馬組織細(xì)胞的凋亡情況,應(yīng)用蛋白免疫印跡試驗(yàn)(Western blot)和免疫組化實(shí)驗(yàn)(IHC)檢測凋亡關(guān)鍵分子Caspase-3、聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(PARP)、腫瘤抑制基因蛋白P53、B淋巴細(xì)胞瘤基因-2蛋白(Bcl2)、Bcl2相關(guān)X蛋白(BAX)、細(xì)胞色素C(Cyt c)以及自噬標(biāo)志蛋白微管相關(guān)蛋白輕鏈3-β(LC3)、自噬體形成關(guān)鍵蛋白Atg7和Beclin1、自噬選擇性底物蛋白P62的表達(dá)水平。結(jié)果:KIO_3暴露4個月后,尿碘檢測結(jié)果顯示,3個KIO_3染毒組4月齡雌鼠尿碘濃度明顯比對照組高(P0.05)。體重結(jié)果顯示各組4月齡雌鼠體重?zé)o顯著差異,但3個KIO_3染毒組雌鼠的腦組織臟器系數(shù)顯著低于對照組(P0.05)。水迷宮前4天的定位航行實(shí)驗(yàn)(PNT)結(jié)果表明各組4月齡雌鼠的逃避潛伏期在第2-4天,3個KIO_3染毒組的4月齡雌鼠逃避潛伏期均長于對照組(P0.05);在第2-4天,3個KIO_3染毒組4月齡雌鼠游離固定平臺的距離均長于對照組(P0.05)。第5天的空間探索實(shí)驗(yàn)(SPT)結(jié)果顯示,2500和5000μg/L KIO_3染毒組的4月齡雌鼠平臺穿越次數(shù)顯著低于對照組(P0.05);與對照組相比,2500和5000μg/L KIO_3染毒組的4月齡雌鼠在目標(biāo)象限中花費(fèi)的游泳時間/游泳距離和總的游泳時間/游泳距離的百分比顯著降低(P0.05)。尼氏染色結(jié)果顯示,各KIO_3染毒組4月齡雌鼠尼氏體數(shù)量顯著低于對照組(P0.05),并且隨著KIO_3染毒劑量的升高,4月齡雌鼠海馬CA3區(qū)中觀察到甲苯胺藍(lán)染色的尼氏體呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢。TEM檢測結(jié)果表明,與對照組相比,3個KIO_3染毒組4月齡雌鼠海馬超微結(jié)構(gòu)顯示出多種異常特征,包括核染色質(zhì)的均質(zhì)化和邊緣化,線粒體損傷(腫脹、膜以及嵴的消失),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,出現(xiàn)許多自噬體和神經(jīng)纖維的脫髓鞘改變。TUNEL試驗(yàn)檢測結(jié)果顯示2500和5000μg/LKIO_3染毒組的4月齡雌鼠海馬CA3區(qū)TUNEL陽性發(fā)生率顯著高于對照(P0.05),并且隨著染毒劑量的升高陽性率也呈現(xiàn)升高的趨勢。Western blot和IHC結(jié)果顯示,與對照組相比,2500和5000μg/LKIO_3染毒組4月齡雌鼠海馬中凋亡相關(guān)蛋白PARP,P53和Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P0.05);此外,與對照組相比,2500和5000μg/LKIO_3染毒組海馬中線粒體凋亡相關(guān)蛋白Bax和Cyt c蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P0.05),而2500和5000μg/L KIO_3染毒組4月齡雌鼠海馬中線粒體凋亡相關(guān)蛋白Bcl2蛋白的表達(dá)水平顯著下降(P0.05);與對照組相比,2500和5000μg/LKIO_3染毒組4月齡雌鼠海馬中自噬形成關(guān)鍵蛋白Atg7、Beclin1和自噬體標(biāo)志蛋白LC3-II表達(dá)水平均顯著升高(P0.05),2500和5000μg/LKIO_3染毒組4月齡雌鼠海馬中自噬底物蛋白p62表達(dá)水平也顯著升高(P0.05)。結(jié)論:高碘暴露會導(dǎo)致4月齡雌鼠的學(xué)習(xí)能力和記憶能力下降,損傷大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)。同時,高碘暴露會導(dǎo)致大鼠海馬發(fā)生凋亡和自噬流紊亂;線粒體凋亡途徑參與了高碘誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,而自噬流紊亂是由自噬體形成的增加和降解的減少所誘導(dǎo)。綜上,凋亡和自噬流紊亂參與了高碘致SD大鼠神經(jīng)毒性的損傷過程。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R595
【圖文】：

圖 2 高碘對大鼠記憶能力的影響（n = 6）：（A）SPT 中的穿環(huán)次數(shù)；（B）SPT 中在目標(biāo)象限所花費(fèi)的時間與總時間的分比；（C）SPT 中在目標(biāo)象限的花費(fèi)的路程與總路程的百分比；（D）SPT 中 4 月齡雌鼠的游泳軌跡。*表示與對照組相比，P<0.05。.4 高碘對大鼠海馬組織中尼氏體數(shù)量的影響從每組隨機(jī)選 3 只雌性大鼠使用尼氏染色法研究高碘對大鼠海馬組織 CA3域中尼氏體的影響。選擇海馬組織 CA3 區(qū)域中尼氏體的 IOD 值作為參數(shù)指標(biāo)反映海馬 CA3 區(qū)域中尼氏體的數(shù)量。結(jié)果表明，與對照組相比，500、2500 5000 μg/L 3 個 KIO3染毒組 4 月齡雌鼠海馬組織中尼氏體數(shù)量明顯減少P<0.05），且隨著攝碘濃度的升高，尼氏體數(shù)量也呈下降趨勢（如圖 3A~I）。

圖 3 高碘對大鼠海馬組織中尼氏小體數(shù)量的影響（n=3）（A-D）海馬組織 CA3 區(qū)域尼氏染色（200 倍）；（E-H）海馬組織 CA3 區(qū)域染色（400 倍）；（I）尼氏體 IOD 值的定量分析。*與對照組相比，P<0.05。 高碘對大鼠海馬組織超微結(jié)構(gòu)的影響從每組中隨機(jī)選擇 3 只雌性大鼠通過 TEM 檢測大鼠海馬組織 CA3 區(qū)域中結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果表明，與對照組相比，500、2500 和 5000 μg/L 3 個 KIO3組 4 月齡雌鼠呈現(xiàn)出多種異常特征。在 500 μg/LKIO3染毒組 4 月齡雌鼠海織 CA3 區(qū)域中，觀察到大量細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征，包括核染色質(zhì)的均質(zhì)邊緣化，還觀察到少量的自噬體（含有線粒體或其他細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物的雙膜）和腫脹的線粒體（如圖 4B 和 F）。在 2500 μg/L KIO3染毒組 4 月齡雌鼠海織 CA3 區(qū)域中，可觀察到許多自噬體、膜消失的線粒體和神經(jīng)纖維的脫髓變（圖 4C 和 G）。在 5000 μg/L KIO3染毒組 4 月齡雌鼠海馬組織 CA3 區(qū)域觀察到了更嚴(yán)重的改變，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，線粒體腫脹以及線粒體嵴的消圖 4D 和 H）。

圖 4 高碘對大鼠海馬組織超微結(jié)構(gòu)的影響（n=3）注：黑色粗體箭頭表示自噬體；黑色細(xì)箭頭表明示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、腫脹；白色粗體箭頭表示線粒體腫脹、嵴消失；白色細(xì)箭頭表示神經(jīng)纖維脫髓鞘；井號表示核染色質(zhì)的均質(zhì)化；星號表示包括核染色質(zhì)的均質(zhì)和邊緣化。2.6 高碘對大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響從每組中隨機(jī)選擇 3 只雌性大鼠使用 TUNEL 試驗(yàn)檢測雌性大鼠海馬 CA3區(qū)域神經(jīng)元細(xì)胞的早期凋亡情況，TUNEL 是通過檢測細(xì)胞發(fā)生凋亡后細(xì)胞中出現(xiàn)的 DNA 斷裂碎片（染色后呈棕黃色）間接反映細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，對照組 4 月齡雌鼠海馬 CA3 區(qū)域中 TUNEL 陽性的神經(jīng)元細(xì)胞很少幾乎看不到，而 2500 和 5000μg/L KIO3染毒組 4 月齡雌鼠海馬 CA3 區(qū)域中 TUNEL 陽性的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量較多，明顯要多于對照組（如圖 5）。

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