發(fā)布時間：2020-07-11 21:02

【摘要】：目的:目前很多實驗研究表明氧化應(yīng)激以及細(xì)胞凋亡在哮喘發(fā)病的過程中起著重要的作用,而特異性免疫治療(Special Immunologic Therapy,SIT)是治療哮喘的唯一根治性治療方法,因此本實驗旨在探討塵螨特異性治療在減輕哮喘氣道細(xì)胞凋亡以及氣道氧化應(yīng)激中的作用以及其機(jī)制的研究。方法:本實驗分為動物部分和細(xì)胞部分。動物實驗:將32只6-8周齡Balb/C小鼠隨機(jī)分為正常對照組、哮喘模型組、SIT組、N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)組。哮喘組、SIT組、NAC組用塵螨粗提液進(jìn)行致敏,SIT組和NAC組在小鼠滴鼻激發(fā)之前進(jìn)行治療干預(yù)。對照組的操作給予PBS處理。激發(fā)后24h內(nèi)進(jìn)行氣道高反應(yīng)性檢測,之后將小鼠處死并采集標(biāo)本。行肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中ROS(Reative Oxygen Species)以及細(xì)胞因子的檢測,肺組織HE染色(Hematoxylin-eosin staining),PAS染色(Periodic Acid-Schiff,PAS),TUNEL凋亡實驗。肺組織冰凍切片檢測活性氧ROS,肺組織勻漿檢測細(xì)胞因子以及MDA,流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry,FCM)檢測Treg細(xì)胞(Regulatory T Cells)。細(xì)胞實驗:分為對照組,IL-25低濃度組,IL-25高濃度組,將重組人IL-25加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中刺激細(xì)胞,分別在12h和24h收集細(xì)胞行細(xì)胞凋亡實驗Annexin V-PI(AV-PI)以及流式檢測ROS實驗。結(jié)果:1.動物實驗:(1)氣道高反應(yīng)性的檢測:哮喘模型組中的小鼠氣道反應(yīng)性較于正常組小鼠有明顯的增高,而SIT組和NAC組小鼠氣道反應(yīng)性較哮喘組中小鼠有所減輕。(2)肺泡灌洗液炎癥細(xì)胞計數(shù):SIT組和NAC組炎癥細(xì)胞總數(shù)以及少于哮喘組,其中嗜酸性粒細(xì)胞比例小于哮喘組。(3)HE染色:SIT組和NAC組小鼠肺組織中炎性細(xì)胞浸潤較哮喘組小鼠有明顯減輕。(4)PAS染色:SIT組和NAC組小鼠氣道粘液分泌較哮喘小鼠有所減輕。(5)TUNEL染色:SIT組和NAC組小鼠肺組織以及氣道細(xì)胞凋亡細(xì)胞明顯較哮喘組小鼠有所減少。(6)s Ig G1,s Ig E以及細(xì)胞因子ELISA:塵螨特異性免疫治療則明顯降低了s Ig G1,s Ig E,IL-4,IL-5,IL-13,IL-25的含量。(7)MDA(丙二醛)檢測:哮喘小鼠肺組織MDA含量明顯升高,而塵螨特異性免疫治療和NAC組明顯降低肺組織中脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA的含量。(8)肺泡灌洗液ROS檢測:哮喘組小鼠肺泡灌洗液細(xì)胞中ROS明顯增多,而SIT組以及NAC組明顯減少了BALF中的ROS生成(9)流式檢測Treg細(xì)胞:SIT治療的哮喘小鼠Treg細(xì)胞數(shù)量相較于正常PBS組和哮喘模型組小鼠有顯著的增多。第二部分:細(xì)胞實驗:(1)Annexin V-PI(AV-PI)凋亡細(xì)胞檢測:IL-25可以明顯上調(diào)16HBE人氣道上皮細(xì)胞的凋亡。(2)流式檢測ROS:IL-25能夠刺激16HBE人氣道上皮細(xì)胞ROS的生成。結(jié)論:第一部分動物實驗:1塵螨特異性免疫治療可以減輕哮喘小鼠氣道高反應(yīng)哮喘癥狀,降低s Ig E水平,并可能通過下調(diào)Treg細(xì)胞減輕哮喘小鼠肺組織的炎癥浸潤。2.塵螨特異性免疫治療可以下調(diào)一系列炎性細(xì)胞因子的表達(dá),可以下調(diào)IL-25的表達(dá)。3.塵螨特異性免疫治療可以減輕哮喘小鼠肺組織氧化應(yīng)激以及肺組織細(xì)胞的凋亡。第二部分:細(xì)胞實驗:1.IL-25細(xì)胞因子可以誘發(fā)HBE細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)。2.IL-25細(xì)胞因子可以誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞的凋亡。
【學(xué)位授予單位】：四川醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R562.25

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本文編號：2750925