【摘要】：[目的]檢測中波紫外線對Jurkat細胞和系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個核細胞自噬水平和miRNA表達的影響;篩選miR-125b-5p的下游靶基因并鑒定;調(diào)控miR-125b-5p及其下游靶基因的表達后檢測中波紫外線照射對細胞自噬水平的影響,以探索中波紫外線通過自噬通路在系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病過程中的作用,以及差異性表達的miRNA在此過程中的作用和調(diào)控機制。[方法]1.使用0-200mj/cm2的中波紫外線對Jurkat細胞進行照射,于照射后12h、24h、48h通過Western-blotting、qPCR、激光共聚焦顯微鏡檢測自噬信號通路標志激活基因(微管相關(guān)蛋白1輕鏈3、Beclin-1)和miR-125b-5p的表達水平。2.使用50mj/cm2的中波紫外線照射系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和正常人的外周血單個核細胞,24h后通過Western-blotting、qPCR檢測自噬信號通路標志激活基因(微管相關(guān)蛋白1輕鏈3、Beclin-1)的表達水平;通過高通量測序(RNA-seq)和miRNA芯片技術(shù)對差異性表達的mRNA和miRNA進行篩選,并使用Western-blotting、qPCR進行鑒定。3.使用生物信息學的方法尋找miR-125b-5p與自噬通路相關(guān)的下游靶基因,通過Western-blotting、qPCR檢測其在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個核細胞中的表達情況。轉(zhuǎn)染miR-125b-5p的激動劑/胎抗劑后通過Western-blotting、qPCR檢測對靶基因表達的影響,共轉(zhuǎn)染miR-125b-5p的模擬物和熒光素酶報告基因載體后通過檢測熒光素酶的比值以確認miR-125b-5p對靶基因3'UTR的作用靶點。4.使用miR-125b-5p的激動劑/拮抗劑、紫外線照射抵抗相關(guān)基因的過表達載體/小干擾RNA轉(zhuǎn)染Jurkat細胞并照射中波紫外線后,通過Western-blotting、qPCR、激光共聚焦顯微鏡檢測自噬通路基因(微管相關(guān)蛋白1輕鏈3、Beclin-1、自噬相關(guān)基因7、紫外線照射抵抗相關(guān)基因)的表達變化。[結(jié)果]1.當中波紫外線照射劑量小于50mj/cm2時,隨劑量的增加,自噬水平逐漸升高;當中波紫外線照射劑量大于50mj/cm2時,隨劑量的增加,自噬水平逐漸降低;50mj/cm2劑量組的自噬水平最高。2.當照射劑量小于50mj/cm2時miR-125b-5p的水平與照射劑量呈負相關(guān),而當照射劑量大于50mj/cm2時miR-125b-5p的水平與照射劑量呈正相關(guān),當照射劑量為50mj/cm2時miR-125b-5p的表達水平最低。3.在未暴露于中波紫外線時,系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和正常對照的外周血單個核細胞內(nèi)自噬標志基因(Beclin-1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 II、自噬相關(guān)基因7、紫外線照射抵抗相關(guān)基因)的水平無明顯差別;在暴露于中波紫外線后,系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的外周血單個核細胞內(nèi)自噬標志基因(Beclin-1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 II、自噬相關(guān)基因7、紫外線照射抵抗相關(guān)基因)的水平顯著上升,而正常對照則無明顯變化。4.在未暴露于中波紫外線的情況下,系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的外周血單個核細胞中miR-125b-5p的表達水平較正常對照組低;暴露于中波紫外線后系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和正常對照的外周血單個核細胞中miR-125b-5p的表達均較未暴露時降低,系統(tǒng)性紅斑狼瘡-中波紫外線組的miR-125b-5p表達水平最低。5.過表達miR-125b-5p可以降低紫外線照射抵抗相關(guān)基因的表達,抑制miR-125b-5p可以提高紫外線照射抵抗相關(guān)基因的表達;miR-125b-5p通過與紫外線照射抵抗相關(guān)基因的3'UTR互補序列結(jié)合,下調(diào)紫外線照射抵抗相關(guān)基因的mRNA和蛋白表達。6.下調(diào)miR-125b-5p的表達或上調(diào)紫外線照射抵抗相關(guān)基因的表達可以提高Jurkat細胞的自噬水平;上調(diào)miR-125b-5p的表達或下調(diào)紫外線照射抵抗相關(guān)基因的表達可以降低Jurkat細胞的自噬水平。[結(jié)論]中波紫外線可以誘發(fā)Jurkat細胞自噬和改變miR-125b-5p的表達水平,其效應(yīng)與照射劑量有關(guān)。中波紫外線通過下調(diào)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的外周血單個核細胞內(nèi)miR-125b-5p的表達水平,上調(diào)紫外線照射抵抗相關(guān)基因的表達,從而促進細胞自噬。
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R593.241
【圖文】：

內(nèi)普遍存在的基本生理活動。自噬異常已被證實與很多疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相逡逑關(guān)［１２］。自噬激活時，形成雙層膜的囊泡，包裹細胞質(zhì)內(nèi)的部分蛋白質(zhì)和細胞器逡逑形成自噬泡，隨后和溶酶體結(jié)合使自噬泡內(nèi)物降解和再利用（圖１）邋［１３？］�，F(xiàn)在逡逑普遍認為自噬是細胞對外來性的創(chuàng)傷防御和應(yīng)激調(diào)控的重要機制。通過自噬作用逡逑和溶酶體結(jié)合，細胞得以消除損傷的線粒體、錯誤折疊的蛋白質(zhì)和某些病原體。逡逑當面臨氧化應(yīng)激、饑餓、電離輻射等應(yīng)激情況下，激活自噬通路，同時對細胞內(nèi)逡逑的多種信號途徑進行調(diào)控，從而達到穩(wěn)定細胞內(nèi)環(huán)境等目的［１５］。逡逑’邐廣、邐Ｐｌａｓｍａ￣￣逡逑Ｔ邐ｄ邋ｍｅｍｂｒａｎｅ逡逑Ｌｙｓｏｓｏｍｅ邋ｆ邋Ｔ逡逑Ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ邋（ＡＰ）邋ｌ逡逑５）邋Ｍａｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ：邋ｎｏｎｎａｌ邋ｆｌｕｘ邋＊逡逑？邋Ｊｊ邐Ａｕｔｏｌｙｓｏｓｏｍｅ邋（ＡＬ）逡逑Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ逡逑圖１．巨自噬的過程示意圖。逡逑自噬在免疫和炎癥性疾病中的作用近年來開始引起了學者們的注意。自噬是逡逑細胞器轉(zhuǎn)換所必需的內(nèi)源性過程，維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)并影響細胞的命運。自噬調(diào)節(jié)逡逑的改變和各種風濕性疾病的進展有關(guān)，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關(guān)節(jié)炎、逡逑骨關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性硬化癥［１６］。全基因組相關(guān)性研宄顯示，ＳＬＥ的發(fā)病與某些自逡逑噬通路基因（ＰＲＤＭ１，ＤＲＡＭ１，ＭＡＰ１ＬＣ３Ｂ，ＡＴＧ５）的多態(tài)性密切相關(guān)［１７＿２１］。逡逑ＳＬＥ患者可能存在對以下過程的調(diào)節(jié)缺陷：干擾素和前炎癥細胞因子分泌、樹突逡逑狀細胞抗原提呈作用、垂死細胞清除等［２２］。與正常小鼠和正常人群相比

將處于不同生長期的培養(yǎng)Ｊｕｒｋａｔ細胞置于倒置顯微鏡下觀察，可見Ｊｕｒｋａｔ逡逑細胞外觀呈圓形，細胞膜折光度強，懸浮于培養(yǎng)基中，成團生長，至對數(shù)生長期逡逑時成團更明顯（圖２）。逡逑＿ｔ＿逡逑圖２．邋Ｊｕｒｋａｔ細胞的顯微鏡下外觀（ｘ２００）。（Ａ）細胞融合度為２０％？３０％逡逑時，可見少量細胞團。（Ｂ）細胞融合度為７０－８０％時，可見大量細胞團，細胞進逡逑入對數(shù)生長期。逡逑２邐ＲＦＰ－ＬＣ３邋Ｊｕｒｋａｔ細胞系的形態(tài)學觀察逡逑使用倒置熒光顯微鏡觀察經(jīng)ＲＦＰ－ＬＣ３慢病毒毒液感染后４８小時的Ｊｕｒｋａｔ細逡逑胞，可見細胞外觀呈圓形，細胞膜折光度強，懸浮于培養(yǎng)基中，成團生長，紅色逡逑熒光蛋白表達率約為２０％？４０％。細胞外形較未感染時無明顯變化，可繼續(xù)用于逡逑后續(xù)實驗（圖３）。逡逑３１逡逑

可見細胞外觀呈圓形，細胞膜折光度強，懸浮于培養(yǎng)基中，成團生長，紅色逡逑熒光蛋白表達率約為２０％？４０％。細胞外形較未感染時無明顯變化，可繼續(xù)用于逡逑后續(xù)實驗（圖３）。逡逑３１逡逑

【參考文獻】

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1 曾芙蓉;徐倩云;劉

本文編號：2747303