【摘要】：[目的]檢測(cè)中波紫外線對(duì)Jurkat細(xì)胞和系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個(gè)核細(xì)胞自噬水平和miRNA表達(dá)的影響;篩選miR-125b-5p的下游靶基因并鑒定;調(diào)控miR-125b-5p及其下游靶基因的表達(dá)后檢測(cè)中波紫外線照射對(duì)細(xì)胞自噬水平的影響,以探索中波紫外線通過自噬通路在系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病過程中的作用,以及差異性表達(dá)的miRNA在此過程中的作用和調(diào)控機(jī)制。[方法]1.使用0-200mj/cm2的中波紫外線對(duì)Jurkat細(xì)胞進(jìn)行照射,于照射后12h、24h、48h通過Western-blotting、qPCR、激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)自噬信號(hào)通路標(biāo)志激活基因(微管相關(guān)蛋白1輕鏈3、Beclin-1)和miR-125b-5p的表達(dá)水平。2.使用50mj/cm2的中波紫外線照射系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和正常人的外周血單個(gè)核細(xì)胞,24h后通過Western-blotting、qPCR檢測(cè)自噬信號(hào)通路標(biāo)志激活基因(微管相關(guān)蛋白1輕鏈3、Beclin-1)的表達(dá)水平;通過高通量測(cè)序(RNA-seq)和miRNA芯片技術(shù)對(duì)差異性表達(dá)的mRNA和miRNA進(jìn)行篩選,并使用Western-blotting、qPCR進(jìn)行鑒定。3.使用生物信息學(xué)的方法尋找miR-125b-5p與自噬通路相關(guān)的下游靶基因,通過Western-blotting、qPCR檢測(cè)其在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)情況。轉(zhuǎn)染miR-125b-5p的激動(dòng)劑/胎抗劑后通過Western-blotting、qPCR檢測(cè)對(duì)靶基因表達(dá)的影響,共轉(zhuǎn)染miR-125b-5p的模擬物和熒光素酶報(bào)告基因載體后通過檢測(cè)熒光素酶的比值以確認(rèn)miR-125b-5p對(duì)靶基因3'UTR的作用靶點(diǎn)。4.使用miR-125b-5p的激動(dòng)劑/拮抗劑、紫外線照射抵抗相關(guān)基因的過表達(dá)載體/小干擾RNA轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞并照射中波紫外線后,通過Western-blotting、qPCR、激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)自噬通路基因(微管相關(guān)蛋白1輕鏈3、Beclin-1、自噬相關(guān)基因7、紫外線照射抵抗相關(guān)基因)的表達(dá)變化。[結(jié)果]1.當(dāng)中波紫外線照射劑量小于50mj/cm2時(shí),隨劑量的增加,自噬水平逐漸升高;當(dāng)中波紫外線照射劑量大于50mj/cm2時(shí),隨劑量的增加,自噬水平逐漸降低;50mj/cm2劑量組的自噬水平最高。2.當(dāng)照射劑量小于50mj/cm2時(shí)miR-125b-5p的水平與照射劑量呈負(fù)相關(guān),而當(dāng)照射劑量大于50mj/cm2時(shí)miR-125b-5p的水平與照射劑量呈正相關(guān),當(dāng)照射劑量為50mj/cm2時(shí)miR-125b-5p的表達(dá)水平最低。3.在未暴露于中波紫外線時(shí),系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和正常對(duì)照的外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)自噬標(biāo)志基因(Beclin-1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 II、自噬相關(guān)基因7、紫外線照射抵抗相關(guān)基因)的水平無明顯差別;在暴露于中波紫外線后,系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)自噬標(biāo)志基因(Beclin-1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 II、自噬相關(guān)基因7、紫外線照射抵抗相關(guān)基因)的水平顯著上升,而正常對(duì)照則無明顯變化。4.在未暴露于中波紫外線的情況下,系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-125b-5p的表達(dá)水平較正常對(duì)照組低;暴露于中波紫外線后系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和正常對(duì)照的外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-125b-5p的表達(dá)均較未暴露時(shí)降低,系統(tǒng)性紅斑狼瘡-中波紫外線組的miR-125b-5p表達(dá)水平最低。5.過表達(dá)miR-125b-5p可以降低紫外線照射抵抗相關(guān)基因的表達(dá),抑制miR-125b-5p可以提高紫外線照射抵抗相關(guān)基因的表達(dá);miR-125b-5p通過與紫外線照射抵抗相關(guān)基因的3'UTR互補(bǔ)序列結(jié)合,下調(diào)紫外線照射抵抗相關(guān)基因的mRNA和蛋白表達(dá)。6.下調(diào)miR-125b-5p的表達(dá)或上調(diào)紫外線照射抵抗相關(guān)基因的表達(dá)可以提高Jurkat細(xì)胞的自噬水平;上調(diào)miR-125b-5p的表達(dá)或下調(diào)紫外線照射抵抗相關(guān)基因的表達(dá)可以降低Jurkat細(xì)胞的自噬水平。[結(jié)論]中波紫外線可以誘發(fā)Jurkat細(xì)胞自噬和改變miR-125b-5p的表達(dá)水平,其效應(yīng)與照射劑量有關(guān)。中波紫外線通過下調(diào)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)miR-125b-5p的表達(dá)水平,上調(diào)紫外線照射抵抗相關(guān)基因的表達(dá),從而促進(jìn)細(xì)胞自噬。
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R593.241
【圖文】：

內(nèi)普遍存在的基本生理活動(dòng)。自噬異常已被證實(shí)與很多疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相逡逑關(guān)［１２］。自噬激活時(shí)，形成雙層膜的囊泡，包裹細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的部分蛋白質(zhì)和細(xì)胞器逡逑形成自噬泡，隨后和溶酶體結(jié)合使自噬泡內(nèi)物降解和再利用（圖１）邋［１３？］�，F(xiàn)在逡逑普遍認(rèn)為自噬是細(xì)胞對(duì)外來性的創(chuàng)傷防御和應(yīng)激調(diào)控的重要機(jī)制。通過自噬作用逡逑和溶酶體結(jié)合，細(xì)胞得以消除損傷的線粒體、錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)和某些病原體。逡逑當(dāng)面臨氧化應(yīng)激、饑餓、電離輻射等應(yīng)激情況下，激活自噬通路，同時(shí)對(duì)細(xì)胞內(nèi)逡逑的多種信號(hào)途徑進(jìn)行調(diào)控，從而達(dá)到穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境等目的［１５］。逡逑’邐廣、邐Ｐｌａｓｍａ￣￣逡逑Ｔ邐ｄ邋ｍｅｍｂｒａｎｅ逡逑Ｌｙｓｏｓｏｍｅ邋ｆ邋Ｔ逡逑Ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ邋（ＡＰ）邋ｌ逡逑５）邋Ｍａｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ：邋ｎｏｎｎａｌ邋ｆｌｕｘ邋＊逡逑？邋Ｊｊ邐Ａｕｔｏｌｙｓｏｓｏｍｅ邋（ＡＬ）逡逑Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ逡逑圖１．巨自噬的過程示意圖。逡逑自噬在免疫和炎癥性疾病中的作用近年來開始引起了學(xué)者們的注意。自噬是逡逑細(xì)胞器轉(zhuǎn)換所必需的內(nèi)源性過程，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)并影響細(xì)胞的命運(yùn)。自噬調(diào)節(jié)逡逑的改變和各種風(fēng)濕性疾病的進(jìn)展有關(guān)，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、逡逑骨關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性硬化癥［１６］。全基因組相關(guān)性研宄顯示，ＳＬＥ的發(fā)病與某些自逡逑噬通路基因（ＰＲＤＭ１，ＤＲＡＭ１，ＭＡＰ１ＬＣ３Ｂ，ＡＴＧ５）的多態(tài)性密切相關(guān)［１７＿２１］。逡逑ＳＬＥ患者可能存在對(duì)以下過程的調(diào)節(jié)缺陷：干擾素和前炎癥細(xì)胞因子分泌、樹突逡逑狀細(xì)胞抗原提呈作用、垂死細(xì)胞清除等［２２］。與正常小鼠和正常人群相比

將處于不同生長(zhǎng)期的培養(yǎng)Ｊｕｒｋａｔ細(xì)胞置于倒置顯微鏡下觀察，可見Ｊｕｒｋａｔ逡逑細(xì)胞外觀呈圓形，細(xì)胞膜折光度強(qiáng)，懸浮于培養(yǎng)基中，成團(tuán)生長(zhǎng)，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期逡逑時(shí)成團(tuán)更明顯（圖２）。逡逑＿ｔ＿逡逑圖２．邋Ｊｕｒｋａｔ細(xì)胞的顯微鏡下外觀（ｘ２００）。（Ａ）細(xì)胞融合度為２０％？３０％逡逑時(shí)，可見少量細(xì)胞團(tuán)。（Ｂ）細(xì)胞融合度為７０－８０％時(shí)，可見大量細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞進(jìn)逡逑入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。逡逑２邐ＲＦＰ－ＬＣ３邋Ｊｕｒｋａｔ細(xì)胞系的形態(tài)學(xué)觀察逡逑使用倒置熒光顯微鏡觀察經(jīng)ＲＦＰ－ＬＣ３慢病毒毒液感染后４８小時(shí)的Ｊｕｒｋａｔ細(xì)逡逑胞，可見細(xì)胞外觀呈圓形，細(xì)胞膜折光度強(qiáng)，懸浮于培養(yǎng)基中，成團(tuán)生長(zhǎng)，紅色逡逑熒光蛋白表達(dá)率約為２０％？４０％。細(xì)胞外形較未感染時(shí)無明顯變化，可繼續(xù)用于逡逑后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖３）。逡逑３１逡逑

可見細(xì)胞外觀呈圓形，細(xì)胞膜折光度強(qiáng)，懸浮于培養(yǎng)基中，成團(tuán)生長(zhǎng)，紅色逡逑熒光蛋白表達(dá)率約為２０％？４０％。細(xì)胞外形較未感染時(shí)無明顯變化，可繼續(xù)用于逡逑后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖３）。逡逑３１逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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1 曾芙蓉;徐倩云;劉

本文編號(hào)：2747303