【摘要】：第一部分腰果酸減輕膠原誘導關節(jié)炎的機制研究目的:腰果酸是一類15-碳烷基鏈含有不同飽和度的6烷基水楊酸的總稱,具有抗癌、抗菌等生物活性。腰果酸作為組蛋白乙酰轉移酶的抑制劑,顯示誘導細胞凋亡的能力。類風濕關節(jié)炎(RA)是一種慢性炎癥性疾病,缺乏有效治愈手段。本部分旨在通過膠原誘導性關節(jié)炎(CIA)小鼠建立類風濕關節(jié)炎模型,研究腰果酸對CIA的保護作用。方法:雌性DBA/1J小鼠(6周齡)共32只,隨機分為4組,每組8只。對照組,造模組,低腰果酸組和高腰果酸組。將100μg雞II型膠原溶解于0.05M乙酸,然后與等體積完全弗氏佐劑充分乳化,并且加入4毫克/毫升熱殺死分枝桿菌。初次免疫于小鼠尾根部2-3cm處皮下注射。21天后,采用100微克雞II型膠原與不完全弗氏佐劑充分乳化進行了加強免疫。正常對照組注射等量的生理鹽水。從加強免疫當天開始,腰果酸組小鼠通過腹腔注射腰果酸,劑量為1或5毫克/千克體重,每周兩次,共注射3周。每周兩次評估關節(jié)炎嚴重指數(shù)。0=沒有征兆;1=手腕或腳踝輕度腫脹;2=從腳踝延伸到跗骨的適度腫脹;3=從腳踝向跖骨關節(jié)延伸的適度腫脹;4=手腕和腳踝嚴重腫脹。免疫后第42天,小鼠被處死,收集血清,對后肢進行解剖并進行組織學分析。小鼠踝關節(jié)置于10%中性福爾馬林溶液中固定,脫鈣,并脫水,石蠟包埋及切片。組織切片接受蘇木精和伊紅染色,由病理專家通過盲評的方式分析各組小鼠踝關節(jié)軟骨的破壞情況。滑膜炎、翳形成、骨侵蝕、軟骨破壞程度按以下標準評分:0、正常;1、輕度變化;2、適度的變化;3、強烈變化。應用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)法測定血清細胞因子TNF-α和IL-1β的水平。結果:正常對照組中小鼠足踝部無紅腫潰爛等現(xiàn)象,關節(jié)炎指數(shù)評分為0;模型組中小鼠出現(xiàn)不同程度急性關節(jié)炎足踝部紅腫癥狀,關節(jié)炎評分在免疫后第6周達到13.86±1.25。使用腰果酸處理后,關節(jié)炎指數(shù)顯著下降,尤其是高濃度腰果酸處理后關節(jié)炎指數(shù)降為3.41±1.18,與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。免疫后第6周,模型組中小鼠血清TNF-α和IL-1β的水平顯著高于對照組(P0.05)。與模型組比較,腰果酸處理組血清TNF-α和IL-1β水平顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。并且,高劑量腰果酸處理對血清TNF-α和IL-1β水平的抑制更明顯。結論:腰果酸可以減輕CIA模型小鼠炎癥反應,這表明腰果酸具有抗炎的效應。其抗炎作用與抑制TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生有關,因而腰果酸可能是一個有效的抗RA藥物。第二部分腰果酸抑制類風濕關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞增殖和侵襲的機制研究目的:成纖維細胞樣滑膜細胞(FLSs)過度增殖以及侵襲是導致RA軟骨和骨骼破壞的一個重要因素。因此,FLSs已成為研究RA發(fā)病機制和治療的獨特靶細胞。微小RNA(micro RNAs)是一類小的非編碼調控RNA,通過靶基因的裂解或蛋白質的轉化抑制來抑制多種基因的表達。本部分擬重點研究腰果酸對RA FLSs的生物學行為的調控作用并深入探討micro RNAs在其中的功能。方法:RA FLSs與不同濃度的腰果酸(530和60μM)孵育,同時添加TNF-α(10ng/m L)或IL-1β(10 ng/m L)。孵育48小時后,收集細胞用于后續(xù)實驗。為了抑制Akt活性,在一些實驗中加入MK-2206(1μM)及TNFα(10 ng/ml)或IL-1β(10 ng/ml),然后孵育48小時,并測量細胞增殖和侵襲情況。RA FLSs應用TNF-α(10 ng/ml)或IL-1β(10 ng/ml)處理48小時之后,細胞與20μM Ed U孵化2小時,細胞采用Hoechst 33342(5 mg/m L)復染。在顯微鏡下對陽性細胞進行了檢查,每孔至少統(tǒng)計300個細胞。取細胞懸液加入Transwell上室。無血清培養(yǎng)液中含不同濃度的腰果酸及TNF-α(10 ng/ml)或IL-1β(10 ng/ml)。下室加入含有10%血清的培養(yǎng)基。孵化后48小時,檢測細胞侵襲情況。應用蛋白免疫印跡和定量PCR法檢測Akt蛋白表達情況。Akt 3′UTR片段經(jīng)PCR擴增然后插入至p GL3熒光素酶報告載體。Akt表達質粒與mi R-633模擬物共同轉染至RA FLSs。我們將Akt 3′UTR報告基因與mi R-633模擬物或對照mi RNA以及海腎熒光素酶表達質粒一起轉染至HEK293T細胞。轉染后48小時,裂解細胞,熒光素酶活性使用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)測量。結果:TNF α和IL 1β誘導的RA FLSs增殖明顯受腰果酸的抑制。此外,腰果酸的抗增殖作用以濃度依賴性的方式存在。Transwell侵襲檢測進一步表明,TNF α和IL 1β誘導的細胞侵襲在腰果酸存在時被減弱。腰果酸處理顯著抑制了Akt的蛋白表達和磷酸化。實時定量PCR分析表明,腰果酸處理對Akt的m RNA表達水平?jīng)]有顯著影響。與對照組相比,腰果酸處理的RA-FLSs中mi R-633的表達水平增加4.8倍以上(P0.05)。mi R-633的過度表達顯著降低了熒光素酶Akt3′UTR的活性。與此一致,mi R-633過度表達顯著抑制Akt在RA-FLSs的蛋白表達,而不改變Akt m RNA的水平。與腰果酸引起的效應類似,mi R-633的過度表達明顯抑制了RA FLSs的增殖和侵襲。進一步實驗表明,過度表達Akt恢復了mi R-633高表達RA FLSs的增殖和侵襲能力。應用化學抑制劑阻斷Akt的活性也導致RA FLSs的增殖和侵襲能力的下降,即使暴露于TNF α和IL 1β的條件。沉默mi R-633增強了RA FLSs對腰果酸誘導的抑制增殖和侵襲活性的抵抗力。此外,下調mi R-633逆轉腰果酸對Akt表達的抑制作用。結論:我們證實了腰果酸具有潛在的抗關節(jié)炎活性。腰果酸介導的抑制RA FLSs的增殖和侵襲與誘導mi R-633和下調Akt表達有關。這些結果表明,腰果酸可能為治療RA提供新的思路。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R593.22
【圖文】：

第一部分：腰果酸對對膠原誘導性關節(jié)炎小鼠的保護作用 結果.1 各組關節(jié)炎指數(shù)的比較正常對照組中小鼠足踝部無紅腫潰爛等現(xiàn)象，關節(jié)炎指數(shù)評分為 0；模型小鼠出現(xiàn)不同程度急性關節(jié)炎足踝部紅腫癥狀，關節(jié)炎評分在免疫后第 6 到 13.86±1.25，提示造模成功（圖 1）。使用腰果酸處理后，關節(jié)炎指數(shù)顯降，尤其是高濃度腰果酸處理后關節(jié)炎指數(shù)降為 3.41±1.18（免疫后第 6 周）模型組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

第一部分：腰果酸對對膠原誘導性關節(jié)炎小鼠的保護作用（P<0.05；圖 2）。與模型組比較，腰果酸處理組血清 TNF- 和 IL-1β 水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05；圖 2）。并且，高劑量腰果酸處理對血清TNF- 和 IL-1β 水平的抑制更明顯。這表明腰果酸具有抗炎的效應。

【參考文獻】

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1 姚茹冰;王圓圓;蔡輝;;Toll樣受體與類風濕關節(jié)炎相關性研究進展[J];中國免疫學雜志;2015年09期

2 張曉軍;劉健;萬磊;孫s

本文編號：2738975