發(fā)布時(shí)間：2020-07-03 01:27

【摘要】：第一部分腰果酸減輕膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的機(jī)制研究目的:腰果酸是一類15-碳烷基鏈含有不同飽和度的6烷基水楊酸的總稱,具有抗癌、抗菌等生物活性。腰果酸作為組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶的抑制劑,顯示誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種慢性炎癥性疾病,缺乏有效治愈手段。本部分旨在通過膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠建立類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型,研究腰果酸對(duì)CIA的保護(hù)作用。方法:雌性DBA/1J小鼠(6周齡)共32只,隨機(jī)分為4組,每組8只。對(duì)照組,造模組,低腰果酸組和高腰果酸組。將100μg雞II型膠原溶解于0.05M乙酸,然后與等體積完全弗氏佐劑充分乳化,并且加入4毫克/毫升熱殺死分枝桿菌。初次免疫于小鼠尾根部2-3cm處皮下注射。21天后,采用100微克雞II型膠原與不完全弗氏佐劑充分乳化進(jìn)行了加強(qiáng)免疫。正常對(duì)照組注射等量的生理鹽水。從加強(qiáng)免疫當(dāng)天開始,腰果酸組小鼠通過腹腔注射腰果酸,劑量為1或5毫克/千克體重,每周兩次,共注射3周。每周兩次評(píng)估關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重指數(shù)。0=沒有征兆;1=手腕或腳踝輕度腫脹;2=從腳踝延伸到跗骨的適度腫脹;3=從腳踝向跖骨關(guān)節(jié)延伸的適度腫脹;4=手腕和腳踝嚴(yán)重腫脹。免疫后第42天,小鼠被處死,收集血清,對(duì)后肢進(jìn)行解剖并進(jìn)行組織學(xué)分析。小鼠踝關(guān)節(jié)置于10%中性福爾馬林溶液中固定,脫鈣,并脫水,石蠟包埋及切片。組織切片接受蘇木精和伊紅染色,由病理專家通過盲評(píng)的方式分析各組小鼠踝關(guān)節(jié)軟骨的破壞情況�；ぱ�、翳形成、骨侵蝕、軟骨破壞程度按以下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分:0、正常;1、輕度變化;2、適度的變化;3、強(qiáng)烈變化。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)法測(cè)定血清細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的水平。結(jié)果:正常對(duì)照組中小鼠足踝部無紅腫潰爛等現(xiàn)象,關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分為0;模型組中小鼠出現(xiàn)不同程度急性關(guān)節(jié)炎足踝部紅腫癥狀,關(guān)節(jié)炎評(píng)分在免疫后第6周達(dá)到13.86±1.25。使用腰果酸處理后,關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著下降,尤其是高濃度腰果酸處理后關(guān)節(jié)炎指數(shù)降為3.41±1.18,與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。免疫后第6周,模型組中小鼠血清TNF-α和IL-1β的水平顯著高于對(duì)照組(P0.05)。與模型組比較,腰果酸處理組血清TNF-α和IL-1β水平顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。并且,高劑量腰果酸處理對(duì)血清TNF-α和IL-1β水平的抑制更明顯。結(jié)論:腰果酸可以減輕CIA模型小鼠炎癥反應(yīng),這表明腰果酸具有抗炎的效應(yīng)。其抗炎作用與抑制TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生有關(guān),因而腰果酸可能是一個(gè)有效的抗RA藥物。第二部分腰果酸抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖和侵襲的機(jī)制研究目的:成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(FLSs)過度增殖以及侵襲是導(dǎo)致RA軟骨和骨骼破壞的一個(gè)重要因素。因此,FLSs已成為研究RA發(fā)病機(jī)制和治療的獨(dú)特靶細(xì)胞。微小RNA(micro RNAs)是一類小的非編碼調(diào)控RNA,通過靶基因的裂解或蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化抑制來抑制多種基因的表達(dá)。本部分?jǐn)M重點(diǎn)研究腰果酸對(duì)RA FLSs的生物學(xué)行為的調(diào)控作用并深入探討micro RNAs在其中的功能。方法:RA FLSs與不同濃度的腰果酸(530和60μM)孵育,同時(shí)添加TNF-α(10ng/m L)或IL-1β(10 ng/m L)。孵育48小時(shí)后,收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為了抑制Akt活性,在一些實(shí)驗(yàn)中加入MK-2206(1μM)及TNFα(10 ng/ml)或IL-1β(10 ng/ml),然后孵育48小時(shí),并測(cè)量細(xì)胞增殖和侵襲情況。RA FLSs應(yīng)用TNF-α(10 ng/ml)或IL-1β(10 ng/ml)處理48小時(shí)之后,細(xì)胞與20μM Ed U孵化2小時(shí),細(xì)胞采用Hoechst 33342(5 mg/m L)復(fù)染。在顯微鏡下對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行了檢查,每孔至少統(tǒng)計(jì)300個(gè)細(xì)胞。取細(xì)胞懸液加入Transwell上室。無血清培養(yǎng)液中含不同濃度的腰果酸及TNF-α(10 ng/ml)或IL-1β(10 ng/ml)。下室加入含有10%血清的培養(yǎng)基。孵化后48小時(shí),檢測(cè)細(xì)胞侵襲情況。應(yīng)用蛋白免疫印跡和定量PCR法檢測(cè)Akt蛋白表達(dá)情況。Akt 3′UTR片段經(jīng)PCR擴(kuò)增然后插入至p GL3熒光素酶報(bào)告載體。Akt表達(dá)質(zhì)粒與mi R-633模擬物共同轉(zhuǎn)染至RA FLSs。我們將Akt 3′UTR報(bào)告基因與mi R-633模擬物或?qū)φ誱i RNA以及海腎熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時(shí),裂解細(xì)胞,熒光素酶活性使用雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量。結(jié)果:TNF α和IL 1β誘導(dǎo)的RA FLSs增殖明顯受腰果酸的抑制。此外,腰果酸的抗增殖作用以濃度依賴性的方式存在。Transwell侵襲檢測(cè)進(jìn)一步表明,TNF α和IL 1β誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲在腰果酸存在時(shí)被減弱。腰果酸處理顯著抑制了Akt的蛋白表達(dá)和磷酸化。實(shí)時(shí)定量PCR分析表明,腰果酸處理對(duì)Akt的m RNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著影響。與對(duì)照組相比,腰果酸處理的RA-FLSs中mi R-633的表達(dá)水平增加4.8倍以上(P0.05)。mi R-633的過度表達(dá)顯著降低了熒光素酶Akt3′UTR的活性。與此一致,mi R-633過度表達(dá)顯著抑制Akt在RA-FLSs的蛋白表達(dá),而不改變Akt m RNA的水平。與腰果酸引起的效應(yīng)類似,mi R-633的過度表達(dá)明顯抑制了RA FLSs的增殖和侵襲。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明,過度表達(dá)Akt恢復(fù)了mi R-633高表達(dá)RA FLSs的增殖和侵襲能力。應(yīng)用化學(xué)抑制劑阻斷Akt的活性也導(dǎo)致RA FLSs的增殖和侵襲能力的下降,即使暴露于TNF α和IL 1β的條件。沉默mi R-633增強(qiáng)了RA FLSs對(duì)腰果酸誘導(dǎo)的抑制增殖和侵襲活性的抵抗力。此外,下調(diào)mi R-633逆轉(zhuǎn)腰果酸對(duì)Akt表達(dá)的抑制作用。結(jié)論:我們證實(shí)了腰果酸具有潛在的抗關(guān)節(jié)炎活性。腰果酸介導(dǎo)的抑制RA FLSs的增殖和侵襲與誘導(dǎo)mi R-633和下調(diào)Akt表達(dá)有關(guān)。這些結(jié)果表明,腰果酸可能為治療RA提供新的思路。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R593.22
【圖文】：

第一部分：腰果酸對(duì)對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠的保護(hù)作用 結(jié)果.1 各組關(guān)節(jié)炎指數(shù)的比較正常對(duì)照組中小鼠足踝部無紅腫潰爛等現(xiàn)象，關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分為 0；模型小鼠出現(xiàn)不同程度急性關(guān)節(jié)炎足踝部紅腫癥狀，關(guān)節(jié)炎評(píng)分在免疫后第 6 到 13.86±1.25，提示造模成功（圖 1）。使用腰果酸處理后，關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯降，尤其是高濃度腰果酸處理后關(guān)節(jié)炎指數(shù)降為 3.41±1.18（免疫后第 6 周）模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

第一部分：腰果酸對(duì)對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠的保護(hù)作用（P<0.05；圖 2）。與模型組比較，腰果酸處理組血清 TNF- 和 IL-1β 水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05；圖 2）。并且，高劑量腰果酸處理對(duì)血清TNF- 和 IL-1β 水平的抑制更明顯。這表明腰果酸具有抗炎的效應(yīng)。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 姚茹冰;王圓圓;蔡輝;;Toll樣受體與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)性研究進(jìn)展[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;2015年09期

2 張曉軍;劉健;萬磊;孫s

本文編號(hào)：2738975