【摘要】：目的:近幾十年來,糖尿病(Diabetes mellitus,DM)的發(fā)病率、致殘率和死亡率都在急劇上升,糖尿病患者由于多種有害刺激,最終導(dǎo)致糖尿病血管并發(fā)癥,主要有視網(wǎng)膜病變、腎臟功能下降、足部缺血性潰瘍和壞疽等,其中足部缺血性潰瘍和壞疽主要是由嚴(yán)重的血液低灌注導(dǎo)致的,與血管缺血性損傷有關(guān),因此促進(jìn)血管生成從而增加血液灌注是治療糖尿病足的一種治療策略。microRNAs(miRNAs)是一種內(nèi)源性非編碼小RNA,可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá),在細(xì)胞增殖、管形成、遷移等細(xì)胞功能中起重要作用。有研究表明miR-328具有調(diào)節(jié)高糖條件下內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換、參與房顫后心房重構(gòu)的過程、腫瘤抑制等作用。本研究旨在觀察miR-328對(duì)糖尿病缺血細(xì)胞模型的血管新生作用及初步探討其作用機(jī)制。方法:我們通過在高糖低血清條件下培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)24 h從而模擬糖尿病引起的血管缺血狀態(tài),通過CCK-8細(xì)胞增殖活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、管形成實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)在高糖低血清條件培養(yǎng)24 h的和正常條件培養(yǎng)24 h的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力、遷移能力和管形成能力,并且通過RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-328分別在高糖低血清條件培養(yǎng)的和正常條件培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá),同時(shí)采用Western Blot實(shí)驗(yàn)觀察血管新生能力標(biāo)志物血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達(dá)和相關(guān)通路蛋白的表達(dá);進(jìn)一步在HUVECs中通過轉(zhuǎn)染NC和miR-328 inhibitor達(dá)到對(duì)照、下調(diào)miR-328表達(dá)水平的目的后,兩組均在高糖低血清條件培養(yǎng)24 h,再以CCK-8細(xì)胞增殖活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在高糖低血清條件培養(yǎng)中臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力、遷移能力和管形成能力,同時(shí)用Western Blot實(shí)驗(yàn)觀察下調(diào)miR-328后HUVECs中VEGF的表達(dá)和miR-328調(diào)控血管新生過程中相關(guān)通路蛋白的表達(dá),用AKT通路抑制劑Periforsin抑制AKT磷酸化后再觀察內(nèi)皮細(xì)胞管形成的變化和AKT/mTOR通路的變化;根據(jù)觀察內(nèi)皮細(xì)胞的功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在miRWalk數(shù)據(jù)庫里(http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/index.html)預(yù)測(cè)miR-328的靶基因,取Target Scan、miRanda、miRDB、miRWalk中的靶基因的交集作為預(yù)測(cè)的靶基因,再將這些預(yù)測(cè)到的靶基因在DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)里進(jìn)行Gene Ontology功能富集分析和KEGG Pathway分析,最后通過閱讀文獻(xiàn),預(yù)測(cè)miR-328調(diào)節(jié)高糖低血清條件影響HUVECs血管新生的靶基因并采用WB實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證靶基因。結(jié)果:內(nèi)皮細(xì)胞血管新生功能實(shí)驗(yàn)顯示:在CCK-8細(xì)胞增殖活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中,在高糖低血清條件下培養(yǎng)的HUVECs增殖活性比正常對(duì)照組的HUVECs增殖活性下降,為正常對(duì)照組的0.65倍(P=0.0004);在細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中,在高糖低血清條件下培養(yǎng)的HUVECs遷移能力比正常對(duì)照組的HUVECs遷移能力下降,為正常對(duì)照組的0.81倍(P=0.0003);在內(nèi)皮細(xì)胞管形成實(shí)驗(yàn)中,在高糖低血清條件下培養(yǎng)的HUVECs管形成能力比正常對(duì)照組的HUVECs管形成能力下降,為正常對(duì)照組的0.45倍(P0.0001);通過RT-qPCR發(fā)現(xiàn)在高糖低血清條件下培養(yǎng)的HUVECs中miR-328表達(dá)水平較正常對(duì)照組的表達(dá)水平增高,為正常對(duì)照組的4.2倍(P0.0001);Western Blot實(shí)驗(yàn)顯示:在高糖低血清條件下培養(yǎng)的HUVECs的VEGF蛋白表達(dá)水平比正常對(duì)照組HUVECs的VEGF蛋白表達(dá)水平下降,為正常對(duì)照組的0.4223倍(P0.0001)。在經(jīng)過轉(zhuǎn)染NC和miR-328 inhibitor分別達(dá)到對(duì)照和下調(diào)miR-328的目的,并且兩組均在高糖低血清條件培養(yǎng)24 h后:在CCK-8細(xì)胞增殖活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中,轉(zhuǎn)染miR-328 inhibitor的實(shí)驗(yàn)組較NC組的HUVECs增殖活性上升,為NC組的1.19倍(P=0.0069);在細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中,轉(zhuǎn)染miR-328 inhibitor的實(shí)驗(yàn)組較NC組的HUVECs遷移能力上升,為NC組的1.23倍(P=0.0038);在內(nèi)皮細(xì)胞管形成實(shí)驗(yàn)中,轉(zhuǎn)染miR-328inhibitor的實(shí)驗(yàn)組較NC組的HUVECs管形成能力上升,為NC組的1.28倍(P=0.0006);Western Blot實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染miR-328 inhibitor的實(shí)驗(yàn)組較NC組HUVECs的VEGF表達(dá)水平上升,為NC組的3.337倍(P=0.0001)。Western Blot實(shí)驗(yàn)觀察通路蛋白結(jié)果顯示:高糖低血清組的p-AKT/AKT蛋白比率為對(duì)照組p-AKT/AKT蛋白比率的0.76倍(P0.0001),得出在高糖低血清的條件下,HUVECs的AKT信號(hào)通路受到抑制;轉(zhuǎn)染NC和miR-328 inhibitor后,轉(zhuǎn)染miR-328 inhibitor組的p-AKT/AKT蛋白比率為轉(zhuǎn)染NC組p-AKT/AKT蛋白比率的4.1倍(P0.0001),轉(zhuǎn)染miR-328inhibitor組的p-mTOR/mTOR蛋白比率為轉(zhuǎn)染NC組p-mTOR/mTOR蛋白比率的1.4倍(P0.05)。用Periforsin抑制AKT磷酸化后:內(nèi)皮細(xì)胞管形成能力受到抑制,AKT/mTOR信號(hào)通路受到抑制(P0.05)。靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果中,miRWalk數(shù)據(jù)庫初步得到miR-328的靶基因有183個(gè),進(jìn)一步Gene Ontology功能富集分析和KEGG Pathway分析顯示,miR-328的靶基因主要與細(xì)胞對(duì)葡萄糖的反應(yīng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、血管新生、細(xì)胞周期停等相關(guān),通過查詢文獻(xiàn),篩選出可能與內(nèi)皮細(xì)胞血管新生有關(guān)的靶基因有:PIM1、MMP16、LYVE1、PTEN,其中我們選擇PIM1進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示下調(diào)miR-328可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞PIM1蛋白的表達(dá)(P0.05);通過KEGG Pathway分析發(fā)現(xiàn),miR-328的靶基因主要涉及的細(xì)胞通路有PI3K-Akt signaling pathway、Insulin resistance、AMPK signaling pathway等共8條信號(hào)通路,其中AKT信號(hào)通路我們已經(jīng)驗(yàn)證與本實(shí)驗(yàn)有關(guān)。結(jié)論:1.高糖低血清條件抑制內(nèi)皮細(xì)胞的血管新生功能(抑制HUVECs的增殖功能、遷移功能、管形成功能),促進(jìn)miR-328的表達(dá)水平。2.高糖低血清條件中下調(diào)miR-328可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的血管新生功能(促進(jìn)HUVECs的增殖功能、遷移功能、管形成功能)。3.miR-328調(diào)控高糖低血清條件內(nèi)皮細(xì)胞的血管新生是通過靶基因PIM1和AKT/mTOR信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R587.2

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本文編號(hào)：2737838