【摘要】：目的:近幾十年來,糖尿病(Diabetes mellitus,DM)的發(fā)病率、致殘率和死亡率都在急劇上升,糖尿病患者由于多種有害刺激,最終導(dǎo)致糖尿病血管并發(fā)癥,主要有視網(wǎng)膜病變、腎臟功能下降、足部缺血性潰瘍和壞疽等,其中足部缺血性潰瘍和壞疽主要是由嚴重的血液低灌注導(dǎo)致的,與血管缺血性損傷有關(guān),因此促進血管生成從而增加血液灌注是治療糖尿病足的一種治療策略。microRNAs(miRNAs)是一種內(nèi)源性非編碼小RNA,可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達,在細胞增殖、管形成、遷移等細胞功能中起重要作用。有研究表明miR-328具有調(diào)節(jié)高糖條件下內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換、參與房顫后心房重構(gòu)的過程、腫瘤抑制等作用。本研究旨在觀察miR-328對糖尿病缺血細胞模型的血管新生作用及初步探討其作用機制。方法:我們通過在高糖低血清條件下培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)24 h從而模擬糖尿病引起的血管缺血狀態(tài),通過CCK-8細胞增殖活性檢測實驗、劃痕實驗、管形成實驗分別檢測在高糖低血清條件培養(yǎng)24 h的和正常條件培養(yǎng)24 h的臍靜脈內(nèi)皮細胞的細胞增殖能力、遷移能力和管形成能力,并且通過RT-qPCR實驗檢測miR-328分別在高糖低血清條件培養(yǎng)的和正常條件培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細胞中的表達,同時采用Western Blot實驗觀察血管新生能力標志物血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達和相關(guān)通路蛋白的表達;進一步在HUVECs中通過轉(zhuǎn)染NC和miR-328 inhibitor達到對照、下調(diào)miR-328表達水平的目的后,兩組均在高糖低血清條件培養(yǎng)24 h,再以CCK-8細胞增殖活性檢測實驗、劃痕實驗、管形成實驗檢測在高糖低血清條件培養(yǎng)中臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖能力、遷移能力和管形成能力,同時用Western Blot實驗觀察下調(diào)miR-328后HUVECs中VEGF的表達和miR-328調(diào)控血管新生過程中相關(guān)通路蛋白的表達,用AKT通路抑制劑Periforsin抑制AKT磷酸化后再觀察內(nèi)皮細胞管形成的變化和AKT/mTOR通路的變化;根據(jù)觀察內(nèi)皮細胞的功能實驗結(jié)果,在miRWalk數(shù)據(jù)庫里(http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/index.html)預(yù)測miR-328的靶基因,取Target Scan、miRanda、miRDB、miRWalk中的靶基因的交集作為預(yù)測的靶基因,再將這些預(yù)測到的靶基因在DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)里進行Gene Ontology功能富集分析和KEGG Pathway分析,最后通過閱讀文獻,預(yù)測miR-328調(diào)節(jié)高糖低血清條件影響HUVECs血管新生的靶基因并采用WB實驗驗證靶基因。結(jié)果:內(nèi)皮細胞血管新生功能實驗顯示:在CCK-8細胞增殖活性檢測實驗中,在高糖低血清條件下培養(yǎng)的HUVECs增殖活性比正常對照組的HUVECs增殖活性下降,為正常對照組的0.65倍(P=0.0004);在細胞劃痕實驗中,在高糖低血清條件下培養(yǎng)的HUVECs遷移能力比正常對照組的HUVECs遷移能力下降,為正常對照組的0.81倍(P=0.0003);在內(nèi)皮細胞管形成實驗中,在高糖低血清條件下培養(yǎng)的HUVECs管形成能力比正常對照組的HUVECs管形成能力下降,為正常對照組的0.45倍(P0.0001);通過RT-qPCR發(fā)現(xiàn)在高糖低血清條件下培養(yǎng)的HUVECs中miR-328表達水平較正常對照組的表達水平增高,為正常對照組的4.2倍(P0.0001);Western Blot實驗顯示:在高糖低血清條件下培養(yǎng)的HUVECs的VEGF蛋白表達水平比正常對照組HUVECs的VEGF蛋白表達水平下降,為正常對照組的0.4223倍(P0.0001)。在經(jīng)過轉(zhuǎn)染NC和miR-328 inhibitor分別達到對照和下調(diào)miR-328的目的,并且兩組均在高糖低血清條件培養(yǎng)24 h后:在CCK-8細胞增殖活性檢測實驗中,轉(zhuǎn)染miR-328 inhibitor的實驗組較NC組的HUVECs增殖活性上升,為NC組的1.19倍(P=0.0069);在細胞劃痕實驗中,轉(zhuǎn)染miR-328 inhibitor的實驗組較NC組的HUVECs遷移能力上升,為NC組的1.23倍(P=0.0038);在內(nèi)皮細胞管形成實驗中,轉(zhuǎn)染miR-328inhibitor的實驗組較NC組的HUVECs管形成能力上升,為NC組的1.28倍(P=0.0006);Western Blot實驗顯示轉(zhuǎn)染miR-328 inhibitor的實驗組較NC組HUVECs的VEGF表達水平上升,為NC組的3.337倍(P=0.0001)。Western Blot實驗觀察通路蛋白結(jié)果顯示:高糖低血清組的p-AKT/AKT蛋白比率為對照組p-AKT/AKT蛋白比率的0.76倍(P0.0001),得出在高糖低血清的條件下,HUVECs的AKT信號通路受到抑制;轉(zhuǎn)染NC和miR-328 inhibitor后,轉(zhuǎn)染miR-328 inhibitor組的p-AKT/AKT蛋白比率為轉(zhuǎn)染NC組p-AKT/AKT蛋白比率的4.1倍(P0.0001),轉(zhuǎn)染miR-328inhibitor組的p-mTOR/mTOR蛋白比率為轉(zhuǎn)染NC組p-mTOR/mTOR蛋白比率的1.4倍(P0.05)。用Periforsin抑制AKT磷酸化后:內(nèi)皮細胞管形成能力受到抑制,AKT/mTOR信號通路受到抑制(P0.05)。靶基因預(yù)測結(jié)果中,miRWalk數(shù)據(jù)庫初步得到miR-328的靶基因有183個,進一步Gene Ontology功能富集分析和KEGG Pathway分析顯示,miR-328的靶基因主要與細胞對葡萄糖的反應(yīng)、細胞增殖、細胞遷移、血管新生、細胞周期停等相關(guān),通過查詢文獻,篩選出可能與內(nèi)皮細胞血管新生有關(guān)的靶基因有:PIM1、MMP16、LYVE1、PTEN,其中我們選擇PIM1進行WB實驗驗證,WB實驗結(jié)果顯示下調(diào)miR-328可促進內(nèi)皮細胞PIM1蛋白的表達(P0.05);通過KEGG Pathway分析發(fā)現(xiàn),miR-328的靶基因主要涉及的細胞通路有PI3K-Akt signaling pathway、Insulin resistance、AMPK signaling pathway等共8條信號通路,其中AKT信號通路我們已經(jīng)驗證與本實驗有關(guān)。結(jié)論:1.高糖低血清條件抑制內(nèi)皮細胞的血管新生功能(抑制HUVECs的增殖功能、遷移功能、管形成功能),促進miR-328的表達水平。2.高糖低血清條件中下調(diào)miR-328可促進內(nèi)皮細胞的血管新生功能(促進HUVECs的增殖功能、遷移功能、管形成功能)。3.miR-328調(diào)控高糖低血清條件內(nèi)皮細胞的血管新生是通過靶基因PIM1和AKT/mTOR信號通路實現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R587.2

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本文編號：2737838