【摘要】：目的:探討長(zhǎng)鏈非編碼RNA-肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄物1(long non coding RNA-metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1,lnc RNA-MALAT1)在糖尿病性視網(wǎng)膜微血管病變中的作用及其機(jī)制。方法:(1)單次腹腔注射鏈脲霉素(Streptozocin,STZ)構(gòu)建大鼠糖尿病模型,RT-PCR檢測(cè)糖尿病大鼠、野生型大鼠的視網(wǎng)膜以及先天糖尿病小鼠、野生型小鼠視網(wǎng)膜中MALAT1的表達(dá)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn),采用原位雜交技術(shù)檢測(cè)猴視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(RF/6A)的MALAT1的表達(dá)情況。(2)野生型大鼠及糖尿病大鼠眼內(nèi)注射MALAT1 sh RNA或Scr sh RNA腺病毒,RT-PCR驗(yàn)證MALAT1的表達(dá)下調(diào)。采用視覺(jué)電生理(ERG)檢測(cè)MALAT1的下調(diào)對(duì)大鼠視覺(jué)功能的影響。采用TUNEL法檢測(cè)MALAT1下調(diào)對(duì)大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的影響。采用視網(wǎng)膜胰酶消化及糖原雪夫染色法檢測(cè)MALAT1下調(diào)對(duì)視網(wǎng)膜周細(xì)胞缺失及無(wú)細(xì)胞血管形成的影響。采用伊凡氏藍(lán)-白蛋白染色法檢測(cè)MALAT1下調(diào)對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管滲漏的影響。采用Western Blotting法檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜中炎癥因子細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達(dá)情況,以探討MALAT1下調(diào)對(duì)糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)影響。(3)小RNA干擾的方法下調(diào)RF/6A細(xì)胞中MALAT1的表達(dá)后,給予高糖(或H2O2)刺激,采用MTT檢測(cè)RF/6A細(xì)胞的活力;采用Hoechst、JC-1、PI與臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞的凋亡或死亡情況,以探究MALAT1是否影響高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。VEGF或TNF-α誘導(dǎo)RF/6A細(xì)胞遷移和成管,采用細(xì)胞劃痕法及基質(zhì)毛細(xì)管發(fā)生實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)MALAT1下調(diào)對(duì)細(xì)胞遷移和成管能力的影響。(4)采用Western blotting法來(lái)檢測(cè)在高糖刺激和MALAT1下調(diào)處理后RF/6A細(xì)胞中p38、JNK及ERK1/2的激活情況,探究MALAT1是否通過(guò)絲裂原激活蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路調(diào)控視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的功能。結(jié)果:(1)MALAT1在糖尿病大鼠和小鼠視網(wǎng)膜中表達(dá)顯著上調(diào)。原位雜交結(jié)果顯示MALAT1在RF/6A細(xì)胞核內(nèi)大量表達(dá)。(2)RT-PCR結(jié)果顯示眼內(nèi)注射MALAT1 sh RNA腺病毒的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中MALAT1表達(dá)水平下調(diào),注射Scr sh RNA腺病毒的沒(méi)有明顯改變。MALAT1表達(dá)下調(diào)后能減輕糖尿病導(dǎo)致視功能下降及視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡;改善周細(xì)胞缺失、無(wú)細(xì)胞血管的形成及血管滲漏;減少視網(wǎng)膜中ICAM-1、VEGF和TNF-α等炎性因子的表達(dá)。(3)高糖或H2O2處理RF/6A細(xì)胞后,細(xì)胞活力下降,下調(diào)MALAT1后,活細(xì)胞的活力進(jìn)一步降低。VEGF或TNF-α處理后RF/6A細(xì)胞遷移與成管能力顯著增加,MALAT1的下調(diào)則降低細(xì)胞遷移與成管能力。(4)MALAT1下調(diào)導(dǎo)致p38磷酸化水平下降,但對(duì)ERK1/2或JNK1/2磷酸化水平?jīng)]有影響。p38抑制劑SB23580預(yù)處理RF/6A細(xì)胞后,能阻斷MALAT1上調(diào)導(dǎo)致RF/6A細(xì)胞的活力增加。然而ERK抑制劑或是JNK抑制劑對(duì)細(xì)胞活性沒(méi)有影響。結(jié)論:MALAT1通過(guò)p38-MAPK通路改善糖尿病性視網(wǎng)膜微血管病變。MALAT1有望成為治療糖尿病性微血管病變的新靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R774.1;R587.2
【圖文】：

在糖尿病大鼠模型建立1月、3月、5月后取新鮮視網(wǎng)膜并提取RNA

南京醫(yī)科大在 RF/6A 細(xì)胞核內(nèi)大量表達(dá) 是一種體內(nèi)組織廣泛存在的保守的長(zhǎng)鏈非編碼 RNA。 在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中、高糖處理的內(nèi)皮細(xì)胞系 RF水和纖維膜中都顯著上調(diào)。的功能失調(diào)是糖尿病微血管并發(fā)癥特征性病理變化。 中 RNA 熒光結(jié)果顯示 MALAT1 在 RF/6A 的細(xì)胞核內(nèi)

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本文編號(hào)：2736858