【摘要】：糖尿病是以胰島素分泌不足或外周組織對胰島素抵抗引起葡萄糖代謝紊亂血糖升高為主要特征的一類代謝性疾病,然而胰島素依賴型糖尿病是目前一種無法完全治愈的慢性疾病。糖尿病及并發(fā)癥需體外注射胰島素藥物治療。目前,研究發(fā)現(xiàn)通過胰腺組織或胰島細(xì)胞移植是一種很有前景的治療方案。然而人類胰腺供體組織來源匱乏,人們將移植替代物轉(zhuǎn)向異種動物-豬。豬胰島素結(jié)構(gòu)與人胰島素結(jié)構(gòu)高度同源并且能夠調(diào)節(jié)胰島細(xì)胞生理活性干預(yù)血糖。研究表明胰腺干細(xì)胞具有較強(qiáng)的自我更新能力及多向分化潛能,可能是獲得大量胰島β細(xì)胞的最佳種子細(xì)胞。因此,近年來人們將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到豬胰腺干細(xì)胞。然而在機(jī)體成熟胰腺組織內(nèi),胰腺干細(xì)胞數(shù)量相對較少且大多數(shù)增殖緩慢。經(jīng)典Wnt信號通路中的Wnt3a分子,其在胚胎發(fā)育、氧化應(yīng)激、線粒體形態(tài)膜電位及干細(xì)胞增殖分化過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用,參與基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞遷移粘附、細(xì)胞衰老凋亡、細(xì)胞極化和自噬等重要生理過程。然而Wnt3a分子是否參與胰腺干細(xì)胞的增殖與分化一直未見可靠報道。本研究在實(shí)驗(yàn)室已有基礎(chǔ)上,探討穩(wěn)定表達(dá)Wnt3a和Dox誘導(dǎo)Wnt3a表達(dá)對豬胰腺干細(xì)胞生物學(xué)特性影響及其可能的分子機(jī)制。研究結(jié)果表明,穩(wěn)定表達(dá)Wnt3a豬胰腺干細(xì)胞具有胰腺干細(xì)胞相關(guān)生物學(xué)特性,激活β-catenin介導(dǎo)的經(jīng)典Wnt信號通路,過表達(dá)Wnt3a引起豬胰腺干細(xì)胞氧化應(yīng)激水平降低、調(diào)節(jié)線粒體膜電位轉(zhuǎn)換,繼而保護(hù)線粒體生理功能,β-catenin靶向降低活性氧水平、抑制豬胰腺干細(xì)胞凋亡。建立Dox誘導(dǎo)Wnt3a表達(dá)調(diào)控豬胰腺干細(xì)胞系統(tǒng),Wnt3a表達(dá)受Dox時間和劑量依賴性調(diào)控,Dox誘導(dǎo)Wnt3a表達(dá)促進(jìn)豬胰腺干細(xì)胞增殖。構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)自噬標(biāo)記LC3豬胰腺干細(xì)胞,建立體外評估自噬活性豬胰腺干細(xì)胞模型,一定程度誘導(dǎo)自噬促進(jìn)豬胰腺干細(xì)胞增殖。在糖尿病發(fā)生和胰腺干細(xì)胞發(fā)育分化過程中,氧化應(yīng)激和胰島β細(xì)胞凋亡及自噬都起到至關(guān)重要的作用,該研究發(fā)現(xiàn)Wnt3a可能通過激活Wnt/β-catenin通路調(diào)控豬胰腺干細(xì)胞的自我更新和抗凋亡。1.穩(wěn)定表達(dá)Wnt3a促進(jìn)豬胰腺干細(xì)胞增殖并抑制其凋亡將重組真核表達(dá)載體p IRES2-Ac GFP-Wnt3a轉(zhuǎn)染豬胰腺干細(xì)胞,在經(jīng)G418抗生素壓力篩選、純化得到穩(wěn)定表達(dá)Wnt3a豬胰腺干細(xì)胞株。經(jīng)檢測,該細(xì)胞穩(wěn)定攜帶Wnt3a基因且呈綠色熒光蛋白陽性表達(dá)。通過細(xì)胞群體倍增生長曲線測定、細(xì)胞周期、Brd U標(biāo)記、QRT-PCR、Western blotting等方法分析顯示,穩(wěn)定表達(dá)Wnt3a豬胰腺干細(xì)胞具有典型間充質(zhì)干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的部分生物學(xué)特性并促進(jìn)細(xì)胞增殖,同時表達(dá)胰腺干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記。利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)和蛋白免疫印跡方法,發(fā)現(xiàn)Wnt3a激活經(jīng)典Wnt信號通路的β-catenin表達(dá)水平。利用流式細(xì)胞術(shù)和線粒體膜電位檢測,發(fā)現(xiàn)經(jīng)典Wnt信號通路具有保護(hù)線粒體膜電位的功能、引起氧化應(yīng)激水平降低;而當(dāng)加入Dkk1抑制Wnt通路后,其結(jié)果與Wnt3a超表達(dá)正好相反。通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn),抑制Wnt通路引起細(xì)胞凋亡率上升,而穩(wěn)定表達(dá)Wnt3a豬胰腺干細(xì)胞的凋亡率明顯降低(前者凋亡率是后者的4倍)。該結(jié)果揭示穩(wěn)定表達(dá)Wnt3a豬胰腺干細(xì)胞通過激活β-catenin抑制豬胰腺干細(xì)胞凋亡。2.Dox誘導(dǎo)Wnt3a表達(dá)促進(jìn)豬胰腺干細(xì)胞增殖將Wnt3a基因克隆至p CDNA4T/O成功構(gòu)建誘導(dǎo)表達(dá)載體p CDNA4T/O-Wnt3a。將質(zhì)粒p CDNA6T/R和p CDNA4T/O-Wnt3a共同轉(zhuǎn)染豬胰腺干細(xì)胞,經(jīng)博萊霉素和殺稻瘟菌素抗生素篩選得到Dox誘導(dǎo)Wnt3a表達(dá)豬胰腺干細(xì)胞,且Dox誘導(dǎo)綠色熒光蛋白表達(dá)。應(yīng)用免疫熒光、QRT-PCR、流式細(xì)胞術(shù)、Western blotting等方法分析顯示,Dox誘導(dǎo)Wnt3a表達(dá)的豬胰腺干細(xì)胞受Dox時間和劑量調(diào)控,并在細(xì)胞上清液中檢測到有分泌蛋白-Wnt3a。Dox誘導(dǎo)Wnt3a表達(dá)豬胰腺干細(xì)胞增殖和分化相關(guān)標(biāo)記:c-Myc、PCNA、PDX1和Glut2。通過細(xì)胞周期、Brd U標(biāo)記和蛋白免疫印跡等方法分析顯示,Dox誘導(dǎo)Wnt3a表達(dá),通過c-Myc和PCNA蛋白表達(dá)水平升高促進(jìn)細(xì)胞增殖;而當(dāng)加入Dkk1后通過下調(diào)β-catenin蛋白表達(dá)水平抑制細(xì)胞增殖。該結(jié)果揭示Dox誘導(dǎo)Wnt3a表達(dá),激活β-catenin靶向c-Myc和PCNA蛋白表達(dá)水平升高促進(jìn)細(xì)胞增殖。該系統(tǒng)為研究Wnt3a調(diào)控胰腺干細(xì)胞的自我更新分子機(jī)制提供了理想細(xì)胞模型和技術(shù)平臺。3.誘導(dǎo)自噬促進(jìn)豬胰腺干細(xì)胞增殖將慢病毒載體p CAG-GFP-LC3和輔助質(zhì)粒p VSV-G及p SPAX2轉(zhuǎn)導(dǎo)293T細(xì)胞,獲取目的基因(GFP-LC3)慢病毒病毒液。將目的基因病毒液轉(zhuǎn)導(dǎo)豬胰腺干細(xì)胞,經(jīng)嘌呤霉素抗生素壓力篩選得到穩(wěn)定表達(dá)自噬標(biāo)記LC3的豬胰腺干細(xì)胞株。經(jīng)PCR、Western blotting和流式細(xì)胞術(shù)檢測,該細(xì)胞穩(wěn)定攜帶LC3基因且呈綠色熒光蛋白表達(dá)陽性。經(jīng)免疫熒光染色分析,該細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記CD90、Vimentin,表達(dá)細(xì)胞增殖標(biāo)記PCNA、c-Myc,同時表達(dá)胰腺干細(xì)胞分化標(biāo)記PDX1和自噬溶酶體底物標(biāo)記p62。應(yīng)用血清饑餓、氯喹、血清饑餓+氯喹和正常對照分別刺激表達(dá)自噬標(biāo)記LC3的豬胰腺干細(xì)胞,激光共聚焦技術(shù)分析評價其對自噬小體的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清饑餓誘導(dǎo)豬胰腺干細(xì)胞自噬,而氯喹顯著抑制自噬。進(jìn)一步利用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期和Brd U標(biāo)記細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)自噬引起豬胰腺干細(xì)胞細(xì)胞周期S期細(xì)胞比例升高、促進(jìn)細(xì)胞增殖,而抑制自噬則引起豬胰腺干細(xì)胞增殖減緩。該結(jié)果揭示一定程度誘導(dǎo)自噬促進(jìn)豬胰腺干細(xì)胞增殖,自噬發(fā)生可能決定豬胰腺干細(xì)胞的自我更新與分化的命運(yùn)。該研究為進(jìn)一步闡明Wnt3a如何通過調(diào)節(jié)自噬、調(diào)控胰腺干細(xì)胞自我更新的分子機(jī)制等研究提供了理想的細(xì)胞模型平臺。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R587.1;Q78

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Essam M Abdelalim;Mohamed M Emara;;Advances and challenges in the differentiation of pluripotent stem cells into pancreatic β cells[J];World Journal of Stem Cells;2015年01期

2 Sarah J Moore;Boris L Gala-Lopez;Andrew R Pepper;Rena L Pawlick;AM James Shapiro;;Bioengineered stem cells as an alternative for islet cell transplantation[J];World Journal of Transplantation;2015年01期

本文編號：2735917