【摘要】：糖尿病是由環(huán)境與遺傳兩個(gè)主要因素長(zhǎng)期共同作用引起的胰島素分泌相對(duì)不足或胰島素抵抗,并以持續(xù)性高血糖為特征性表現(xiàn)的自身代謝性疾病。主要包括I型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus,T1DM)與II型糖尿病(Type 2 diabetes mel itus,T2DM),其中T2DM占糖尿病發(fā)病率的90%以上。T2DM患者體內(nèi)糖代謝異常與脂代謝異常是并存的,并且糖毒性與脂毒性在T2DM的發(fā)生發(fā)展中并非孤立起作用,兩者之間相互協(xié)同。研究表明,高血糖能夠促進(jìn)FFA誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞的凋亡。FFA能通過(guò)抑制胰島素分泌,降低葡萄糖利度等多種機(jī)制進(jìn)一步增加血液中葡萄糖濃度,加重高血糖程度,從而構(gòu)成糖脂混合毒性(glucolipotoxicity,GP)。絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPKs)廣泛分布于各種動(dòng)物體內(nèi),在細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、死亡等一系列生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用,是調(diào)控生命活動(dòng)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一,在T2DM信號(hào)通路中充當(dāng)重要角色。絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶(Mitogen-activated protein kinase phosphatases,MPKs)又稱(chēng)雙特異性磷酸酶,能夠通過(guò)去磷酸化使MAPKs失活,這種負(fù)向調(diào)控調(diào)節(jié)作用,在細(xì)胞的應(yīng)激、增殖、分化、凋亡等活動(dòng)中發(fā)揮重要作用,其異常表達(dá)與糖尿病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。MKP5是MKP家族成員之一,已有研究表明其在機(jī)體代謝及T2DM中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。然而,MKP5在GP誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡以及功能障礙中具體機(jī)制仍有待探明。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建MKP5過(guò)表達(dá)小鼠MIN6細(xì)胞系,探討MKP5在GP誘導(dǎo)小鼠胰島β細(xì)胞凋亡、功能障礙中的作用及其潛在分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?探討MKP5在糖脂毒性誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞凋亡、功能障礙中的作用及其潛在的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法:(1)MKP5過(guò)表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建與鑒定:取本實(shí)驗(yàn)已構(gòu)建成功的pcDNA3.1-MKP5質(zhì)粒與pcDNA3.1空質(zhì)粒對(duì)MIN6細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。構(gòu)建MKP5基因過(guò)表達(dá)的MIN6穩(wěn)定細(xì)胞系(MIN6-MKP5)以及對(duì)照組細(xì)胞系(MIN6-PC),使用Western Blot法對(duì)轉(zhuǎn)染后的MIN6-PC、MIN6-MKP5兩種細(xì)胞中MKP-5蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢驗(yàn)。(2)細(xì)胞增殖檢測(cè):糖脂毒性(33.3mM葡萄糖、0.4Mm PA)作用MIN6-PC、MIN6-MKP5兩種細(xì)胞24h后,使用CCK-8試劑檢測(cè)MKP-5基因?qū)IN6細(xì)胞增殖的影響。(3)細(xì)胞凋亡分析:A.糖脂毒性作用MIN6-PC、MIN6-MKP5兩種細(xì)胞24h后,使用Hoechst 33258染色法初步分析MKP-5基因在糖脂毒性誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞凋亡中的影響。B.AnnexinV-FICT/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞儀分析糖脂毒性作用MIN6-PC、MIN6-MKP5兩種細(xì)胞18h后的凋亡率。(4)Realtime PCR檢測(cè)相關(guān)基因水平變化:糖脂毒性作用MIN6-PC、MIN6-MKP5兩種細(xì)胞12h后,采用Realtime PCR檢測(cè)與凋亡(Bcl-2、Bax)、功能(PDX-1)、氧化應(yīng)激(NOX4、p22phox)相關(guān)的基因水平變化。(5)Western Blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白水平變化:糖脂毒性作用MIN6-PC、MIN6-MKP5兩種細(xì)胞0、24h后,采用Western Blot法檢測(cè)與凋亡(Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9)、功能(GLUT2)相關(guān)的蛋白表達(dá)水平變化。(6)細(xì)胞活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)水平檢測(cè):使用DCFH-DA熒光探針結(jié)合熒光酶標(biāo)儀分析糖脂毒性作用MIN6-PC、MIN6-MKP5兩種細(xì)胞24h后的ROS水平。(7)MAPK信號(hào)通路磷酸化水平檢測(cè):糖脂毒性作用MIN6-PC、MIN6-MKP5兩種細(xì)胞0、1、3、6、9、12h后,采用Western Blot法檢測(cè)P38、ERK、JNK三種信號(hào)通路蛋白磷酸化水平的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)Western結(jié)果表明,與MIN6-PC組細(xì)胞相比,MIN6-MKP5組細(xì)胞中MKP-5蛋白表達(dá)明顯升高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,MKP-5過(guò)表達(dá)MIN6細(xì)胞系構(gòu)建成功。(2)CCK-8結(jié)果顯示,MIN6-PC組細(xì)胞活力下降20%,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。MIN6-MKP5糖脂協(xié)同處理組細(xì)胞活力為(73.27±2.33)%,較MIN6-PC糖脂協(xié)同處理組細(xì)胞(42.70±2.47)%,明顯升高。MIN6-MKP5乙醇對(duì)照組細(xì)胞活力較MIN6-PC乙醇對(duì)照組細(xì)胞活力升高40%(P0.05),該實(shí)驗(yàn)表明MPK-5能夠緩解高糖高脂對(duì)胰島β細(xì)胞增殖抑制的作用。(3)細(xì)胞凋亡分析結(jié)果:A.Hoechst結(jié)果表明:MPK-5可能在糖脂毒性誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮一定作用。B.Annexin-V-FICT/PI試劑與流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡,結(jié)果表明:MIN6-MKP5糖脂處理組細(xì)胞凋亡率明顯低于MIN6-PC糖脂處理組細(xì)胞凋亡率。此結(jié)果與Hoechst 33258染色法檢測(cè)MIN6細(xì)胞凋亡結(jié)果基本一致。(4)Realtime PCR結(jié)果顯示:MIN6-PC糖脂處理組Bcl-2與Bax比值較其乙醇對(duì)照組降低47%,與MIN6-MKP5糖脂處理組相比降低顯著(P0.05);MIN6-MKP5組細(xì)胞NOX4、p22phox基因mRNA的表達(dá)均顯著低于MIN6-PC組細(xì)胞(P0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,MKP-5能夠有效抑制ROS相關(guān)基因NOX4與p22phox的表達(dá);Western Blot結(jié)果顯示,MIN6-MKP5組細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)量始終處于較低水平;MIN6-PC糖脂處理組細(xì)胞PDX-1基因mRNA的表達(dá)明顯低于MIN6-MKP5糖脂處理組(P0.05)。(5)Western Blot結(jié)果顯示,與其自身空白對(duì)照組相比,MIN6-PC組細(xì)胞與MIN6-MKP5組細(xì)胞Caspase-3與Caspase-9的活化水平均明顯升高。MIN6-MKP5組細(xì)胞Caspase-3與Caspase-9蛋白活化水平均顯著低于MIN6-PC組細(xì)胞。MIN6-PC組細(xì)胞與MIN6-MKP5組細(xì)胞糖脂處理組GLUT2蛋白表達(dá)量均明顯下降,但MIN6-MKP5組細(xì)胞空白對(duì)照組與糖脂處理組GLUT2蛋白表達(dá)量均高于MIN6-PC組細(xì)胞;(6)ROS結(jié)果表明,MIN6-MKP5糖脂處理組細(xì)胞與其乙醇對(duì)照組相比,升高并不明顯。而MIN6-PC糖脂處理組細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高顯著,是其乙醇對(duì)照組的近2倍(P0.05)。MIN6-MKP5糖脂處理組細(xì)胞ROS水平升高明顯低于MIN6-PC糖脂處理組(P0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,MKP-5能夠有效抑制由糖脂毒性誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞內(nèi)ROS水平的增加。(7)Western Blot檢測(cè)MAPK信號(hào)通路磷酸化水平,結(jié)果表明MKP-5基因具有抑制P38、JNK蛋白活化的作用;與P38蛋白與JNK蛋白不同的是,隨著糖脂協(xié)同處理過(guò)程中,MIN6-PC與MIN6-MKP5兩種細(xì)胞的ERK蛋白活化水平并無(wú)顯著差異,表明MKP-5在MIN6細(xì)胞中,對(duì)MAPK家族中JNK、P38通路下調(diào)作用明顯,對(duì)ERK通路的調(diào)節(jié)作用不顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:(1)MKP-5通過(guò)下調(diào)p38、JNK通路參與調(diào)控糖脂毒性誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡及功能障礙;(2)MKP-5可能通過(guò)線(xiàn)粒體途徑緩解糖脂毒性誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡及功能障礙。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R587.1
【圖文】：

4.1 穩(wěn)定表達(dá) MKP-5 細(xì)胞系的鑒定使用 Western Blot 法對(duì)轉(zhuǎn)染后的 MIN6-PC、MIN6-MKP5 兩種細(xì)胞中 MKP-5蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果顯示（圖4.1），與MIN6-PC組細(xì)胞相比，MIN6-MKP5組細(xì)胞中 MKP-5 蛋白表達(dá)明顯升高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MKP-5 過(guò)表達(dá) MIN6 細(xì)胞系構(gòu)建成功。圖 4.1 穩(wěn)定表達(dá) MKP-5 基因細(xì)胞系 MIN6-MKP5 的鑒定A.Western Blot 檢測(cè) MIN-PC、MIN-MKP5 細(xì)胞系中 MKP-5 蛋白的表達(dá)B.重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果柱形圖統(tǒng)計(jì)分析 *P<0.05, MIN-PC vs MIN-MKP54.2 MKP-5 在糖脂毒性刺激 MIN6 細(xì)胞增殖中的影響為了分析 MKP-5 在糖脂協(xié)同刺激 MIN6 細(xì)胞增殖中的作用，采用 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞活力（圖 4.2），結(jié)果顯示，糖脂協(xié)同刺激（33.3mM 葡萄糖與 0.4mM PA，用 GP 表示）MIN6-PC、MIN6-MKP5 兩組細(xì)胞 24h后，MIN6-PC GP 組細(xì)胞活

第 4 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果其乙醇對(duì)照組下降 20%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。MIN6-MKP5 GP 處細(xì)胞活力為（73.27±2.33）%，較MIN6-PC GP處理組細(xì)胞活力（42.70±2.47）%升高。此外，MIN6-MKP5 乙醇對(duì)照組細(xì)胞活力較 MIN6-PC 乙醇對(duì)照組力升高 40%（P<0.05），該實(shí)驗(yàn)表明 MPK-5 能夠緩解高糖高脂對(duì)胰島 β 細(xì)增殖抑制作用。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Tyler ZARUBIN;Activation and signaling of the p38 MAP kinase pathway[J];Cell Research;2005年01期

2 ;MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells[J];Cell Research;2002年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 龔蕾;高糖致胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制及年齡相關(guān)胰島β細(xì)胞再生的研究[D];山東大學(xué);2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 費(fèi)洪強(qiáng);P38在軟脂酸誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡中的作用[D];上海交通大學(xué);2008年

本文編號(hào)：2731331