【摘要】：糖尿病是由環(huán)境與遺傳兩個主要因素長期共同作用引起的胰島素分泌相對不足或胰島素抵抗,并以持續(xù)性高血糖為特征性表現(xiàn)的自身代謝性疾病。主要包括I型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus,T1DM)與II型糖尿病(Type 2 diabetes mel itus,T2DM),其中T2DM占糖尿病發(fā)病率的90%以上。T2DM患者體內(nèi)糖代謝異常與脂代謝異常是并存的,并且糖毒性與脂毒性在T2DM的發(fā)生發(fā)展中并非孤立起作用,兩者之間相互協(xié)同。研究表明,高血糖能夠促進FFA誘導(dǎo)胰島β細胞的凋亡。FFA能通過抑制胰島素分泌,降低葡萄糖利度等多種機制進一步增加血液中葡萄糖濃度,加重高血糖程度,從而構(gòu)成糖脂混合毒性(glucolipotoxicity,GP)。絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPKs)廣泛分布于各種動物體內(nèi),在細胞生長、發(fā)育、死亡等一系列生理活動中發(fā)揮重要作用,是調(diào)控生命活動重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一,在T2DM信號通路中充當(dāng)重要角色。絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶(Mitogen-activated protein kinase phosphatases,MPKs)又稱雙特異性磷酸酶,能夠通過去磷酸化使MAPKs失活,這種負向調(diào)控調(diào)節(jié)作用,在細胞的應(yīng)激、增殖、分化、凋亡等活動中發(fā)揮重要作用,其異常表達與糖尿病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。MKP5是MKP家族成員之一,已有研究表明其在機體代謝及T2DM中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。然而,MKP5在GP誘導(dǎo)胰島β細胞凋亡以及功能障礙中具體機制仍有待探明。本實驗通過構(gòu)建MKP5過表達小鼠MIN6細胞系,探討MKP5在GP誘導(dǎo)小鼠胰島β細胞凋亡、功能障礙中的作用及其潛在分子機制。實驗?zāi)康?探討MKP5在糖脂毒性誘導(dǎo)MIN6細胞凋亡、功能障礙中的作用及其潛在的分子機制。實驗方法:(1)MKP5過表達穩(wěn)定細胞系構(gòu)建與鑒定:取本實驗已構(gòu)建成功的pcDNA3.1-MKP5質(zhì)粒與pcDNA3.1空質(zhì)粒對MIN6細胞進行轉(zhuǎn)染。構(gòu)建MKP5基因過表達的MIN6穩(wěn)定細胞系(MIN6-MKP5)以及對照組細胞系(MIN6-PC),使用Western Blot法對轉(zhuǎn)染后的MIN6-PC、MIN6-MKP5兩種細胞中MKP-5蛋白表達情況進行檢驗。(2)細胞增殖檢測:糖脂毒性(33.3mM葡萄糖、0.4Mm PA)作用MIN6-PC、MIN6-MKP5兩種細胞24h后,使用CCK-8試劑檢測MKP-5基因?qū)IN6細胞增殖的影響。(3)細胞凋亡分析:A.糖脂毒性作用MIN6-PC、MIN6-MKP5兩種細胞24h后,使用Hoechst 33258染色法初步分析MKP-5基因在糖脂毒性誘導(dǎo)MIN6細胞凋亡中的影響。B.AnnexinV-FICT/PI雙染法結(jié)合流式細胞儀分析糖脂毒性作用MIN6-PC、MIN6-MKP5兩種細胞18h后的凋亡率。(4)Realtime PCR檢測相關(guān)基因水平變化:糖脂毒性作用MIN6-PC、MIN6-MKP5兩種細胞12h后,采用Realtime PCR檢測與凋亡(Bcl-2、Bax)、功能(PDX-1)、氧化應(yīng)激(NOX4、p22phox)相關(guān)的基因水平變化。(5)Western Blot法檢測相關(guān)蛋白水平變化:糖脂毒性作用MIN6-PC、MIN6-MKP5兩種細胞0、24h后,采用Western Blot法檢測與凋亡(Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9)、功能(GLUT2)相關(guān)的蛋白表達水平變化。(6)細胞活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)水平檢測:使用DCFH-DA熒光探針結(jié)合熒光酶標(biāo)儀分析糖脂毒性作用MIN6-PC、MIN6-MKP5兩種細胞24h后的ROS水平。(7)MAPK信號通路磷酸化水平檢測:糖脂毒性作用MIN6-PC、MIN6-MKP5兩種細胞0、1、3、6、9、12h后,采用Western Blot法檢測P38、ERK、JNK三種信號通路蛋白磷酸化水平的變化。實驗結(jié)果:(1)Western結(jié)果表明,與MIN6-PC組細胞相比,MIN6-MKP5組細胞中MKP-5蛋白表達明顯升高。實驗結(jié)果表明,MKP-5過表達MIN6細胞系構(gòu)建成功。(2)CCK-8結(jié)果顯示,MIN6-PC組細胞活力下降20%,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。MIN6-MKP5糖脂協(xié)同處理組細胞活力為(73.27±2.33)%,較MIN6-PC糖脂協(xié)同處理組細胞(42.70±2.47)%,明顯升高。MIN6-MKP5乙醇對照組細胞活力較MIN6-PC乙醇對照組細胞活力升高40%(P0.05),該實驗表明MPK-5能夠緩解高糖高脂對胰島β細胞增殖抑制的作用。(3)細胞凋亡分析結(jié)果:A.Hoechst結(jié)果表明:MPK-5可能在糖脂毒性誘導(dǎo)的胰島β細胞凋亡過程中發(fā)揮一定作用。B.Annexin-V-FICT/PI試劑與流式細胞儀檢測細胞凋亡,結(jié)果表明:MIN6-MKP5糖脂處理組細胞凋亡率明顯低于MIN6-PC糖脂處理組細胞凋亡率。此結(jié)果與Hoechst 33258染色法檢測MIN6細胞凋亡結(jié)果基本一致。(4)Realtime PCR結(jié)果顯示:MIN6-PC糖脂處理組Bcl-2與Bax比值較其乙醇對照組降低47%,與MIN6-MKP5糖脂處理組相比降低顯著(P0.05);MIN6-MKP5組細胞NOX4、p22phox基因mRNA的表達均顯著低于MIN6-PC組細胞(P0.05)。實驗結(jié)果表明,MKP-5能夠有效抑制ROS相關(guān)基因NOX4與p22phox的表達;Western Blot結(jié)果顯示,MIN6-MKP5組細胞Caspase-3蛋白表達量始終處于較低水平;MIN6-PC糖脂處理組細胞PDX-1基因mRNA的表達明顯低于MIN6-MKP5糖脂處理組(P0.05)。(5)Western Blot結(jié)果顯示,與其自身空白對照組相比,MIN6-PC組細胞與MIN6-MKP5組細胞Caspase-3與Caspase-9的活化水平均明顯升高。MIN6-MKP5組細胞Caspase-3與Caspase-9蛋白活化水平均顯著低于MIN6-PC組細胞。MIN6-PC組細胞與MIN6-MKP5組細胞糖脂處理組GLUT2蛋白表達量均明顯下降,但MIN6-MKP5組細胞空白對照組與糖脂處理組GLUT2蛋白表達量均高于MIN6-PC組細胞;(6)ROS結(jié)果表明,MIN6-MKP5糖脂處理組細胞與其乙醇對照組相比,升高并不明顯。而MIN6-PC糖脂處理組細胞內(nèi)ROS水平升高顯著,是其乙醇對照組的近2倍(P0.05)。MIN6-MKP5糖脂處理組細胞ROS水平升高明顯低于MIN6-PC糖脂處理組(P0.05)。實驗結(jié)果表明,MKP-5能夠有效抑制由糖脂毒性誘導(dǎo)的胰島β細胞內(nèi)ROS水平的增加。(7)Western Blot檢測MAPK信號通路磷酸化水平,結(jié)果表明MKP-5基因具有抑制P38、JNK蛋白活化的作用;與P38蛋白與JNK蛋白不同的是,隨著糖脂協(xié)同處理過程中,MIN6-PC與MIN6-MKP5兩種細胞的ERK蛋白活化水平并無顯著差異,表明MKP-5在MIN6細胞中,對MAPK家族中JNK、P38通路下調(diào)作用明顯,對ERK通路的調(diào)節(jié)作用不顯著。實驗結(jié)論:(1)MKP-5通過下調(diào)p38、JNK通路參與調(diào)控糖脂毒性誘導(dǎo)的胰島β細胞凋亡及功能障礙;(2)MKP-5可能通過線粒體途徑緩解糖脂毒性誘導(dǎo)的胰島β細胞凋亡及功能障礙。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R587.1
【圖文】：

4.1 穩(wěn)定表達 MKP-5 細胞系的鑒定使用 Western Blot 法對轉(zhuǎn)染后的 MIN6-PC、MIN6-MKP5 兩種細胞中 MKP-5蛋白表達情況進行檢驗。結(jié)果顯示（圖4.1），與MIN6-PC組細胞相比，MIN6-MKP5組細胞中 MKP-5 蛋白表達明顯升高。實驗結(jié)果表明，MKP-5 過表達 MIN6 細胞系構(gòu)建成功。圖 4.1 穩(wěn)定表達 MKP-5 基因細胞系 MIN6-MKP5 的鑒定A.Western Blot 檢測 MIN-PC、MIN-MKP5 細胞系中 MKP-5 蛋白的表達B.重復(fù)實驗結(jié)果柱形圖統(tǒng)計分析 *P<0.05, MIN-PC vs MIN-MKP54.2 MKP-5 在糖脂毒性刺激 MIN6 細胞增殖中的影響為了分析 MKP-5 在糖脂協(xié)同刺激 MIN6 細胞增殖中的作用，采用 CCK-8 檢測細胞活力（圖 4.2），結(jié)果顯示，糖脂協(xié)同刺激（33.3mM 葡萄糖與 0.4mM PA，用 GP 表示）MIN6-PC、MIN6-MKP5 兩組細胞 24h后，MIN6-PC GP 組細胞活

第 4 章 實驗結(jié)果其乙醇對照組下降 20%，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。MIN6-MKP5 GP 處細胞活力為（73.27±2.33）%，較MIN6-PC GP處理組細胞活力（42.70±2.47）%升高。此外，MIN6-MKP5 乙醇對照組細胞活力較 MIN6-PC 乙醇對照組力升高 40%（P<0.05），該實驗表明 MPK-5 能夠緩解高糖高脂對胰島 β 細增殖抑制作用。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

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相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 龔蕾;高糖致胰島微血管內(nèi)皮細胞凋亡的機制及年齡相關(guān)胰島β細胞再生的研究[D];山東大學(xué);2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

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本文編號：2731331