【摘要】：背景:Graves病(GD)是除I型糖尿病外最常見的自身免疫紊亂性內(nèi)分泌疾病,也是成人持續(xù)甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)最常見的原因,嚴(yán)重者可因誘發(fā)甲狀腺危象、甲亢心等導(dǎo)致死亡。由于目前GD的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,目前尚不能針對其病因進(jìn)行治療,故GD復(fù)發(fā)率高;因此有必要進(jìn)一步探索GD的病因和發(fā)病機(jī)制。微小RNA-146a(miR-146a)是一種新型的真核生物基因和免疫調(diào)控因子,可通過差異性表達(dá)以及直接降低其靶mRNAs的表達(dá)量或抑制其翻譯成蛋白質(zhì)而參與多種自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制。外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)是免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)細(xì)胞,明確miR-146a及其潛在免疫相關(guān)性靶mRNAs在GD患者PBMCs中的表達(dá)情況有利于進(jìn)一步探索GD的發(fā)病機(jī)制。目的:探討miR-146a及其免疫相關(guān)性靶mRNAs在GD患者PBMCs中的表達(dá)情況及臨床意義。方法:1.收集30例初發(fā)GD患者、28例治療期GD患者、31例緩解期GD患者和26例健康志愿者的清晨空腹EDTA-K2抗凝靜脈血,密度梯度離心法分離純化得到PBMCs,Trizol法提取PBMCs中的總RNAs。采用加poly(A)尾法和常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄方法分別將總RNAs中的miRNAs和mRNAs逆轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的cDNA,再采用實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)法檢測PBMCs中miR-146a及其免疫相關(guān)性靶mRNAs的相對表達(dá)量,并與各臨床因子進(jìn)行相關(guān)性分析。miR-146a免疫相關(guān)性靶mRNAs包括白介素-8(IL-8)、白介素1受體相關(guān)激酶1/2(IRAK1/2)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)、CC趨化因子配體5/8(CCL5/CCL8)和Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(FADD)的mRNAs。2.采用SPSS24.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的連續(xù)性計量資料以?x?s表示;符合偏態(tài)分布的連續(xù)性計量資料以M(P25,P75)表示。所用統(tǒng)計學(xué)方法包括t檢驗(yàn)、t'檢驗(yàn)、Mann-Whitney U檢驗(yàn)、kruskal-wallis 1-way ANOVA檢驗(yàn)、?~2檢驗(yàn)以及Spearman相關(guān)分析。所有檢驗(yàn)均認(rèn)為P0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。應(yīng)用GraPhPad Prism 5作圖。結(jié)果:1.GD初診組和GD治療組的PBMCs中,miR146a的表達(dá)水平均顯著低于健康對照組和GD緩解組(P0.05);IL-8和CCL8的mRNA的表達(dá)水平與之呈現(xiàn)顯著相反的變化趨勢(P0.05)。2.GD緩解組與健康對照組的PBMCs中,miR-146以及IL-8和CCL8的mRNAs的表達(dá)量均無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。3.相較于GD初診組,GD治療組的PBMCs中IL-8的mRNAs的表達(dá)量降低(P0.05),而miR146a以及CCL8的mRNA的表達(dá)量無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。4.相較于健康對照組,GD初診組的PBMCs中CCL5和TRAF6的mRNAs的表達(dá)量顯著降低(P0.05),IRAK1、IRAK2和FADD的mRNAs的表達(dá)量無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。5.PBMCs中的miR-146a表達(dá)水平與IL-8、CCL8的mRNAs的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.294,r=-0.298,P0.05),與血清總?cè)饧谞钕僭彼?TT3)、總甲狀腺素(TT4)、總?cè)饧谞钕僭彼?FT3)、游離甲狀腺素(FT4)和促甲狀腺激素受體抗體(TRAb)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.343,r=-0.347,r=-0.374,r=-0.409,r=-0.302,P0.01),且與血清促甲狀腺激素(TSH)水平呈正相關(guān)(r=0.391,P0.01)。6.PBMCs中的IL-8的mRNA表達(dá)水平與血清TSH水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.549,P0.01),與TT3、TT4、FT3、FT4和TRAb水平呈正相關(guān)(r=0.552,r=0.529,r=0.591,r=0.602,r=0.464,P0.01)。7.PBMCs中的CCL8的mRNA表達(dá)水平與TSH水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.325,P0.01),與TT3、FT3、FT4和TRAb水平呈正相關(guān)(r=0.215,r=0.217,r=0.215,r=0.370,P0.05),但與TT4表達(dá)表達(dá)水平無顯著相關(guān)性(P0.05)。結(jié)論:PBMCs中的miR-146a與GD密切相關(guān),其可能通過抑制其靶基因IL-8和CCL8的mRNAs的表達(dá)而在GD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用,其表達(dá)水平可以作為預(yù)測GD疾病狀態(tài)的輔助生物檢驗(yàn)學(xué)指標(biāo),未來也可能成為治療GD的生物學(xué)靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：湖北醫(yī)藥學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R581.1
【圖文】：

圖 3.1 各組間甲狀腺功能及 TRAb 水平比較注：（1）HC（健康對照組）；nGD(GD 初診組)；tGD(GD 治療組)；eGD(GD 緩解組);（2） A~F 分別為血清 TSH、TT3、TT4、FT3、FT4 和 TRAb 水平；（3）各組間比較，*表示 P＜0.05，**表示 P<0.01。2. miR-146a 及其靶 mRNAs 的 real-time PCR 熔點(diǎn)曲線結(jié)果qRT-PCR 結(jié)束后，在 60~95 C 對 miR-146a 及其免疫相關(guān)性靶 mRNAs 的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行溶解曲線分析以判斷引物特異性。結(jié)果顯示各擴(kuò)增產(chǎn)物均在特定溫度顯示唯一的單峰，未出現(xiàn)二聚體，說明各引物具有良好的特異性，符合相對熒光定量 PCR 檢測要求。（表 3.2，圖 3.2）表 3.2 miR-146a 及其靶 mRNAs 的擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解溫度（Tm 值）名稱 Tm 值（ C） 名稱 Tm 值（ C） 名稱 Tm值（ C） 名稱 Tm 值（ C）U6 80.32 miR-146a 77.69 -actin 86.68 IL-8 82.38IRAK1 88.31 IRAK2 84.66 TRAF6 82.30 FADD 85.04

圖 3.2 miR-146a 及其免疫相關(guān)性靶 mRNAs 熔點(diǎn)曲線結(jié)果A~J 分別為 U6、miR-146a 以及 -actin、IL-8、IRAK1、IRAK2、TRAF6、FAD 的 mRNAs 的熔點(diǎn)曲線結(jié)果由圖可知，各擴(kuò)增產(chǎn)物均在特定溫度顯示唯一的單峰，說明各引物具有良 qRT-PCR 相對定量檢測標(biāo)準(zhǔn)。-146a 及其靶 mRNAs 的相對表達(dá)水平比較及相關(guān)性分 HC 組相比，nGD 組患者 PBMCs 中的 miR-146a 以及 TRAF6 和 s 的相對表達(dá)量顯著下降（P<0.01）；IL-8 和 CCL8 的 mRNAs 的表達(dá)（P<0.05）；IRAK1、IRAK2 及 FADD 的 mRNAs 的表達(dá)水平則無顯（P>0.05）。（表 3.3，圖 3.3）于 miR-146a 與 IL-8 和 CCL-8 的 mRNAs 的相對表達(dá)水平趨勢相反pearman 相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，miR-146a 表達(dá)水平與 IL-8 的 mR呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.294，P=0.029<0.05），與 CCL8 的 mRNA 的表相關(guān)性（r=-0.298，P=0.032<0.05）。

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