【摘要】：目的:1、探討Graves病患者血清來源外泌體(Exosome,exo)與正常人血清來源的外泌體是否存在質和量的差異。2、探究Graves病患者分泌的外泌體,是否與樹突細胞的TLR2或TLR3結合,促進炎癥反應。方法:本研究選取2016年至2019年于中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院門診就診的初發(fā)Graves病患者26例(3名男性,23名女性),炎癥活動期未進行激素沖擊的Graves眼病(Graves ophthalmopathy,GO)患者7例(5名男性,2名女性)。從社區(qū)人群選取年齡、性別、BMI大致匹配的健康志愿者作為患者的對照組。抽取患者與對照組自愿者血液離心得到血清,分別使用試劑盒與超速離心機兩種方法提取exo。首先使用蛋白免疫印跡方法(Western blot,WB)檢測外泌體標志物CD63的表達,透射電鏡分析其形態(tài),外泌體濃度粒徑分析其大小及濃度,對提取的外泌體進行鑒定;BCA試劑盒法來測定外泌體的濃度,評估初發(fā)Graves病、炎癥活動期未進行激素沖擊GO患者與對照組相比血清來源外泌體濃度有無差異;Western blot檢測外泌體中甲狀腺的特異性抗原。對患者血液中TRAb與血清來源外泌體中IGF-1R、HSP60、TPO蛋白水平進行相關性分析;初發(fā)Graves病患者與對照組自愿者血清通過超速離心方法提取的外泌體與健康人來源外周血單核細胞(PBMC)共培養(yǎng)24h,共聚焦顯微鏡檢測外泌體與Toll樣受體在細胞的定位情況。流式染色細胞分析CD11c+TLR2+、CD11c+TLR3+的表達情況。ELISA檢測細胞上清中炎癥因子IL-1β、IL-6的表達情況。結果:(1)通過兩種方法(試劑盒、超速離心法)獲取的直徑在30-150nm的扁圓型微泡,同時表達外泌體標志蛋白CD63,可鑒定為外泌體。(2)Graves病患者、炎癥活動期未進行激素沖擊GO患者、健康志愿者血清來源外泌體濃度上無差異。(3)對Graves病組患者、炎癥活動期未進行激素沖擊GO患者與健康志愿者血清來源外泌體進行WB蛋白組分分析,結果顯示Graves病患者、炎癥活動期未進行激素沖擊GO患者中外泌體IGF-1R、TPO、HSP60表達明顯高于對照組,TSHR在三組間無明顯差異�；颊哐褐蠺RAb與血清來源外泌體中IGF-1R表達存在顯著正相關。(4)共聚焦顯微鏡顯示熒光標記的外泌體可被細胞攝取,與Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)共同表達在PBMC細胞上。(5)Graves病患者與健康人血清來源外泌體與健康志愿者來源的PBMC共培養(yǎng)24h,細胞流式分析顯示Graves病患者血清外泌體促進CD11c+TLR2+、CD11c+TLR3+表達增高;(6)共培養(yǎng)24h的Graves病組細胞上清中細胞因子(IL-6、IL-1β)水平明顯高于對照組結論:(1)Graves病組、未進行激素沖擊GO患者組與對照組比較,血清外泌體濃度無明顯差異,但蛋白組分IGF-1R、TPO和HSP60表達增高;(2)Graves病患者血清外泌體促進PBMC中CD11c+TLR2+、CD11c+TLR3+表達增高,HSP60是TLR2的配體,HSP60表達增高,推測外泌體中HSP60可能與樹突細胞中TLR2結合,刺激PBMC分泌炎癥因子(IL-6、IL-1β),可促進炎癥反應的發(fā)生。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R581
【圖文】：

外泌體在適應性免疫發(fā)揮作用機制（ZhangBetal.FrontiersinImmunology,2014,5:518）

圖 3 NTA 測量外泌體的大小與濃度注：峰值在 30-100nm 以內，單峰，96.9%粒子徑在 87.8nm 附近，峰值濃度在 2.7×106particles/ml3.2.2 超速離心方法提取外泌體電鏡觀察結果

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本文編號：2719640