【摘要】：第一部分VEGF-B信號(hào)通路在追趕生長(zhǎng)小鼠骨骼肌中的變化及與骨骼肌脂質(zhì)沉積的關(guān)系目的:1.探究VEGF-B信號(hào)通路在追趕生長(zhǎng)小鼠骨骼肌中的變化情況。2.探究VEGF-B信號(hào)通路在追趕生長(zhǎng)小鼠骨骼肌中脂質(zhì)沉積中發(fā)揮的作用。方法:1.6周齡C57BL/6J小鼠共72只隨機(jī)分為三組:(1)正常對(duì)照組(NC):正常普通飲食12周;(2)追趕生長(zhǎng)組(RN):50%熱卡限食4周后開放正常飲食8周;(3)追趕生長(zhǎng)病毒干預(yù)組(RN+AAV9):骨骼肌局部病毒干預(yù)后追趕生長(zhǎng)組。2.分別于限食4周末、開放飲食8周末對(duì)小鼠進(jìn)行如下檢測(cè):(1)行糖耐量試驗(yàn)(IPGTT)與胰島素耐量試驗(yàn)(IGITT)以評(píng)估小鼠機(jī)體胰島素敏感性;(2)3HOA灌胃,評(píng)估小鼠骨骼肌局部脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)情況;(3)檢測(cè)小鼠血清中血脂相關(guān)指標(biāo)變化情況;(4)檢測(cè)骨骼肌中脂質(zhì)沉積情況;(5)檢測(cè)骨骼肌中VEGF-B信號(hào)通路變化情況。結(jié)果:1.限食4周末,追趕生長(zhǎng)小鼠骨骼肌中VEGF-B信號(hào)通路處于激活狀態(tài),骨骼肌局部胰島素敏感性增加,骨骼肌對(duì)脂肪酸的攝取增加。2.開放飲食8周后,追趕生長(zhǎng)小鼠骨骼肌中脂質(zhì)沉積較對(duì)照組增加,VEGF-B信號(hào)通路處于持續(xù)激活狀態(tài),骨骼肌局部出現(xiàn)明顯胰島素抵抗,骨骼肌對(duì)脂肪酸的攝取明顯增加。3.下調(diào)VEGF-B表達(dá)后,追趕生長(zhǎng)小鼠在開放飲食8周末,骨骼肌局部脂質(zhì)沉積減輕,胰島素敏感性得到改善,骨骼肌對(duì)脂肪酸的攝取明顯下降。結(jié)論:1.VEGF-B信號(hào)通路介導(dǎo)了追趕生長(zhǎng)小鼠骨骼肌中脂質(zhì)沉積。2.干擾VEGF-B信號(hào)通路可減輕追趕生長(zhǎng)小鼠骨骼肌中脂肪酸的攝取及脂質(zhì)沉積,改善追趕生長(zhǎng)小鼠骨骼肌胰島素敏感性。第二部分表觀遺傳修飾在追趕生長(zhǎng)過程中對(duì)骨骼肌VEGF-B變化的調(diào)控作用目的:探究DNA甲基化修飾及組蛋白甲基化修飾在追趕生長(zhǎng)過程中骨骼肌VEGF-B變化中發(fā)揮的作用。方法:1.在我們課題組前期已構(gòu)建成功的追趕生長(zhǎng)大鼠模型上,采用重亞硫酸鹽處理測(cè)序(BSP)的方法,檢測(cè)追趕生長(zhǎng)大鼠(RN)及正常飲食大鼠(NC)脛骨前肌中Vegfb啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化的變化情況。2.采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)(q PCR)篩選可能調(diào)控組蛋白甲基化修飾的相關(guān)組蛋白甲基化酶,隨后采用免疫印跡技術(shù)(Western Blotting)及染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(CHIPq PCR)驗(yàn)證發(fā)生改變的甲基化酶或去甲基化酶是否參與了Vegfb的變化調(diào)控。3.體外培養(yǎng)L6成肌細(xì)胞,通過干擾或過表達(dá)相關(guān)去甲基化酶的表達(dá),進(jìn)一步確定去甲基化酶對(duì)VEGF-B表達(dá)的調(diào)控作用。結(jié)果:1.Vegfb啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平在正常組及追趕生長(zhǎng)組中未發(fā)現(xiàn)明顯異常。2.PHF2作為一種去甲基化酶,在限食末期及開放飲食8周末,均出現(xiàn)明顯下降,其調(diào)控的Vegfb啟動(dòng)子區(qū)H3K9me1的表達(dá)量也相應(yīng)地升高。3.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),PHF2可通過調(diào)節(jié)Vegfb啟動(dòng)子區(qū)H3K9me1的水平來(lái)調(diào)控VEGF-B的表達(dá)。結(jié)論:在追趕生長(zhǎng)過程中,去甲基化轉(zhuǎn)移酶PHF2可通過調(diào)控H3K9me1來(lái)調(diào)節(jié)VEGF-B的表達(dá)。 【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R587.1

【圖文】：

12 小時(shí)照明與 12 小時(shí)黑暗交替進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)小鼠均給予單籠飼養(yǎng)，充足飲水，給予高壓滅菌過的普通飼料喂養(yǎng)。專人負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)小鼠的飼養(yǎng)，每日定時(shí)檢測(cè)小鼠的體重、食物攝入量及生長(zhǎng)狀況，每 3-5 天補(bǔ)充飲用水并更換墊料。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分組以進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。2.1.2 實(shí)驗(yàn)小鼠的分組及造模方法小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為三組：（1）正常對(duì)照組（NC，24 只）：給予普通飼料正常飲食共 12 周；（2）追趕生長(zhǎng)組（RN，24 只）：50%熱卡限食 4 周，開放飲食8 周，共 12 周；（3）追趕生長(zhǎng)+AAV 病毒局部干預(yù)組（RN+AAV9，24 只）：脛骨前肌一側(cè)給予肌肉局部注射 AAV9 病毒局部干預(yù) VEGF-B、對(duì)側(cè)局部注射 AAV9-Control 病毒后再適應(yīng)喂養(yǎng)一周，隨后進(jìn)行 50%熱卡限食 4 周，開放飲食 8 周，共計(jì) 13 周。每個(gè)組均可分為兩個(gè)亞組：限食 4 周末，可分為 NC4、R4、R4+AAV9 組；開放飲食 8周末，可分為 NC12、RN8、RN8+AAV9 組。

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文組相比，P < 0.01。2 AAV9 病毒注射后肌肉感染情況評(píng)估100 倍熒光顯微鏡下可見，小鼠脛骨前肌注射 4W 及 12W 后，，AAV9 均能明顯感染骨骼肌組織（圖 2）。相應(yīng)地，與正常組小鼠（NC）相比，注射 AAV9-shVegfb 后的小鼠 VEGF-B 的 mRNA 及蛋白表達(dá)水平明顯下降（P < 0.05，圖 3A 及 3B），在第 12周，注射干擾病毒小鼠 VEGF-B 的表達(dá)下降得更為明顯（P < 0.01，圖 3A 及 3B）。

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本文編號(hào)：2712308