【摘要】：目的:脂肪酸轉運蛋白CD36對骨骼肌細胞攝取脂肪酸具有重要的促進和調控功能。但過量的脂肪酸供應會導致CD36在細胞膜上長期駐留,使細胞對脂肪酸的攝取增加,最終引發(fā)胰島素抵抗。但是脂肪酸誘導CD36轉位的機制還不清楚。本課題將以高脂飲食喂養(yǎng)的C57小鼠和棕櫚酸誘導的L6骨骼肌細胞為模型,探討在高脂條件下,骨骼肌細胞中調控CD36轉位的分子機制。本課題的實施有助于我們進一步了解血脂異常導致胰島素抵抗的發(fā)病機理,并可為藥物開發(fā)與干涉治療提供有價值的靶點。方法:通過高脂喂養(yǎng)C57小鼠和含有棕櫚酸(PA)的培養(yǎng)基處理L6骨骼肌細胞,確定胰島素抵抗發(fā)生的時間點;使用細胞膜蛋白分離方法分析蛋白在細胞膜上的分布情況;以熒光標記的能量底物檢測細胞在不同條件下對葡萄糖和脂肪酸的攝取;通過化學阻斷劑和shRNA轉染研究相關蛋白的功能及相關激酶的上下游關系;以免疫熒光方法檢測組織及細胞中蛋白的分布以及細胞骨架的形態(tài)變化;通過Western-blot檢測組織和細胞中相關蛋白的表達、活性及分布。結果:高脂在引發(fā)胰島素抵抗之前就可增加脂肪酸轉運蛋白CD36在細胞膜上的分布。CD36結合細胞外的脂肪酸后可抑制細胞內Fyn的活性,導致LKB1由細胞核轉移到細胞質中,激活位于細胞質中的AMPK。在PA引發(fā)的信號通路中,AMPK位于PKCζ上游并可激活PKCζ�；罨蟮腜KCζ調控actin的結構,使之發(fā)生actin結構重塑,進而促進CD36向膜遷移。上膜后的CD36會介導細胞攝取更多的脂肪酸。本研究揭示了高脂通過CD36-Fyn-LKB1-AMPK-PKCζ-actin信號通路傳導,使更多的CD36遷移到細胞膜上的分子機制。
【圖文】：

高脂飼料喂養(yǎng) C57 小鼠，對照組以正常飼料喂養(yǎng)。每隔兩周測定體重，進行口服葡萄糖耐量測試（OGTT），處死正常飲食組（NCD）和高脂飲食組（HFD）的老鼠，取血液測定血脂水平，取肌肉組織固定（用于形態(tài)學觀察）或者液氮冷凍（用于蛋白檢測）。隨著時間的推移，檢測高脂飲食引起小鼠葡萄糖耐受性降低情況，確定高脂喂養(yǎng)可導致小鼠糖脂代謝紊亂和胰島素抵抗發(fā)生以及出現(xiàn)病理變化所對應的時間點。3.1.1高脂喂養(yǎng)小鼠胰島素抵抗時間確定高脂喂養(yǎng) C57 小鼠兩個月，對小鼠進行 OGTT 檢測。實驗結果顯示，對照組與高脂組 OGTT 結果沒有差異，說明糖耐量沒有損傷，胰島素抵抗尚未形成。高脂喂養(yǎng) C5小鼠四個月，對小鼠進行 OGTT 檢測的結果顯示，高脂喂養(yǎng)組 OGTT 與對照組出現(xiàn)顯著性差異，并且空腹血糖明顯升高，超過了 11 mmol/L。說明出現(xiàn)了糖耐量損傷，胰島素抵抗形成。

圖 2 小鼠血脂相關指標檢測結果。（a）自由脂肪酸檢測；(b)甘油三酯檢測；(c) 總膽固醇檢測。n=10，*p<0.05，**p<0.01，#p<0.05 vs NCD 2Mon，，##p<0.01 vs NCD 2Mon。3.1.3小鼠發(fā)生胰島素抵抗之前骨骼肌中脂肪酸攝取相關蛋白檢測取正常（NCD）及高脂（HFD）喂養(yǎng)小鼠兩個月的后腿骨骼肌，勻漿后 Western-blot檢測總蛋白，同時分離、檢測細胞膜蛋白。實驗結果顯示，與正常喂養(yǎng)組做比較，高脂喂養(yǎng)組骨骼肌細胞膜上 CD36 分布顯著增加，而 GLUT4 在細胞膜上的分布沒有變化，說明肌細胞對脂肪酸的攝取增加了。另外，PKCζ 和 AMPK 的活性顯著增加，Akt 的活性沒有變化。
【學位授予單位】：深圳大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R329.2

【參考文獻】

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1 遲毓婧;李晶;管又飛;楊吉春;;PI3K-Akt信號傳導通路對糖代謝的調控作用[J];中國生物化學與分子生物學報;2010年10期

2 孫捷,孔儉,鄭永晨;糖尿病大鼠心肌GluT_4mRNA的表達水平[J];中國老年學雜志;2000年03期

本文編號：2710677