【摘要】：目的:脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CD36對(duì)骨骼肌細(xì)胞攝取脂肪酸具有重要的促進(jìn)和調(diào)控功能。但過量的脂肪酸供應(yīng)會(huì)導(dǎo)致CD36在細(xì)胞膜上長(zhǎng)期駐留,使細(xì)胞對(duì)脂肪酸的攝取增加,最終引發(fā)胰島素抵抗。但是脂肪酸誘導(dǎo)CD36轉(zhuǎn)位的機(jī)制還不清楚。本課題將以高脂飲食喂養(yǎng)的C57小鼠和棕櫚酸誘導(dǎo)的L6骨骼肌細(xì)胞為模型,探討在高脂條件下,骨骼肌細(xì)胞中調(diào)控CD36轉(zhuǎn)位的分子機(jī)制。本課題的實(shí)施有助于我們進(jìn)一步了解血脂異常導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)理,并可為藥物開發(fā)與干涉治療提供有價(jià)值的靶點(diǎn)。方法:通過高脂喂養(yǎng)C57小鼠和含有棕櫚酸(PA)的培養(yǎng)基處理L6骨骼肌細(xì)胞,確定胰島素抵抗發(fā)生的時(shí)間點(diǎn);使用細(xì)胞膜蛋白分離方法分析蛋白在細(xì)胞膜上的分布情況;以熒光標(biāo)記的能量底物檢測(cè)細(xì)胞在不同條件下對(duì)葡萄糖和脂肪酸的攝取;通過化學(xué)阻斷劑和shRNA轉(zhuǎn)染研究相關(guān)蛋白的功能及相關(guān)激酶的上下游關(guān)系;以免疫熒光方法檢測(cè)組織及細(xì)胞中蛋白的分布以及細(xì)胞骨架的形態(tài)變化;通過Western-blot檢測(cè)組織和細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)、活性及分布。結(jié)果:高脂在引發(fā)胰島素抵抗之前就可增加脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CD36在細(xì)胞膜上的分布。CD36結(jié)合細(xì)胞外的脂肪酸后可抑制細(xì)胞內(nèi)Fyn的活性,導(dǎo)致LKB1由細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中,激活位于細(xì)胞質(zhì)中的AMPK。在PA引發(fā)的信號(hào)通路中,AMPK位于PKCζ上游并可激活PKCζ。活化后的PKCζ調(diào)控actin的結(jié)構(gòu),使之發(fā)生actin結(jié)構(gòu)重塑,進(jìn)而促進(jìn)CD36向膜遷移。上膜后的CD36會(huì)介導(dǎo)細(xì)胞攝取更多的脂肪酸。本研究揭示了高脂通過CD36-Fyn-LKB1-AMPK-PKCζ-actin信號(hào)通路傳導(dǎo),使更多的CD36遷移到細(xì)胞膜上的分子機(jī)制。
【圖文】：

高脂飼料喂養(yǎng) C57 小鼠，對(duì)照組以正常飼料喂養(yǎng)。每隔兩周測(cè)定體重，進(jìn)行口服葡萄糖耐量測(cè)試（OGTT），處死正常飲食組（NCD）和高脂飲食組（HFD）的老鼠，取血液測(cè)定血脂水平，取肌肉組織固定（用于形態(tài)學(xué)觀察）或者液氮冷凍（用于蛋白檢測(cè)）。隨著時(shí)間的推移，檢測(cè)高脂飲食引起小鼠葡萄糖耐受性降低情況，確定高脂喂養(yǎng)可導(dǎo)致小鼠糖脂代謝紊亂和胰島素抵抗發(fā)生以及出現(xiàn)病理變化所對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)。3.1.1高脂喂養(yǎng)小鼠胰島素抵抗時(shí)間確定高脂喂養(yǎng) C57 小鼠兩個(gè)月，對(duì)小鼠進(jìn)行 OGTT 檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組與高脂組 OGTT 結(jié)果沒有差異，說明糖耐量沒有損傷，胰島素抵抗尚未形成。高脂喂養(yǎng) C5小鼠四個(gè)月，對(duì)小鼠進(jìn)行 OGTT 檢測(cè)的結(jié)果顯示，高脂喂養(yǎng)組 OGTT 與對(duì)照組出現(xiàn)顯著性差異，并且空腹血糖明顯升高，超過了 11 mmol/L。說明出現(xiàn)了糖耐量損傷，胰島素抵抗形成。

圖 2 小鼠血脂相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果。（a）自由脂肪酸檢測(cè)；(b)甘油三酯檢測(cè)；(c) 總膽固醇檢測(cè)。n=10，*p<0.05，**p<0.01，#p<0.05 vs NCD 2Mon，，##p<0.01 vs NCD 2Mon。3.1.3小鼠發(fā)生胰島素抵抗之前骨骼肌中脂肪酸攝取相關(guān)蛋白檢測(cè)取正常（NCD）及高脂（HFD）喂養(yǎng)小鼠兩個(gè)月的后腿骨骼肌，勻漿后 Western-blot檢測(cè)總蛋白，同時(shí)分離、檢測(cè)細(xì)胞膜蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常喂養(yǎng)組做比較，高脂喂養(yǎng)組骨骼肌細(xì)胞膜上 CD36 分布顯著增加，而 GLUT4 在細(xì)胞膜上的分布沒有變化，說明肌細(xì)胞對(duì)脂肪酸的攝取增加了。另外，PKCζ 和 AMPK 的活性顯著增加，Akt 的活性沒有變化。
【學(xué)位授予單位】：深圳大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 遲毓婧;李晶;管又飛;楊吉春;;PI3K-Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)糖代謝的調(diào)控作用[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2010年10期

2 孫捷,孔儉,鄭永晨;糖尿病大鼠心肌GluT_4mRNA的表達(dá)水平[J];中國老年學(xué)雜志;2000年03期

本文編號(hào)：2710677