發(fā)布時間：2020-06-11 15:58

【摘要】：目的:通過分離、培養(yǎng)正常脂肪來源干細胞(normal Adipose-derived stem cells,nASCs)與糖尿病脂肪來源干細胞(diabetic Adipose-derived stem cells,dASCs),體外對比研究兩種細胞的形態(tài)、表面標志、增殖與分化功能,體內(nèi)對比研究兩種細胞局部移植后壓瘡創(chuàng)面的愈合情況,探討dASCs是否保留促創(chuàng)面愈合能力,為dASCs自體移植治療慢性創(chuàng)面提供實驗依據(jù)。方法:1、經(jīng)知情同意后,于遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院燒傷整形外科患者術(shù)中無菌條件下獲取糖尿病病人脂肪組織和非糖尿病病人脂肪組織(即正常的脂肪組織)標本。采用膠原酶消化法提取脂肪來源干細胞(Adipose-derived stem cells,ASCs),用含胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞,胰酶消化傳代。倒置顯微鏡下觀察兩種不同來源細胞的形態(tài),流式細胞儀檢測第三代細胞表面標志的表達情況。2、取傳至第三代的nASCs和dASCs,采用MTT法檢測兩種來源細胞的增殖能力并繪制生長曲線;將兩種細胞接種于六孔板后分別誘導成脂、成骨,21天后分別行油紅及茜素紅染色觀察成脂及成骨情況;取誘導成骨及成脂兩周后的細胞進行實時熒光定量PCR檢測脂肪特有基因PPAR-γ及成骨基因骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)和骨鈣素(BGP)mRNA的表達情況。3、建立小鼠背部皮膚壓瘡動物模型,隨機分三組:nASCs移植組、dASCs移植組及PBS組(對照組,NC),每組8只。取增殖期的第三代細胞,用病毒包被好的綠色熒光蛋白(GFP)進行細胞轉(zhuǎn)染標記細胞后,分別于每個壓瘡周邊及基底部多點注射1×10~6個相應(yīng)細胞,PBS組注射同等體積的PBS,觀察創(chuàng)面的愈合情況。分別于注射后11天、21天分批處死小鼠后切取壓瘡創(chuàng)面組織行HE染色和Masson染色,觀察創(chuàng)面組織炎癥細胞浸潤程度、表皮厚度及膠原蛋白沉積情況;進行CD31及S100免疫組化染色觀察創(chuàng)面血管及神經(jīng)細胞再生情況;第11天取創(chuàng)面組織行冰凍包埋切片追蹤兩種細胞在創(chuàng)面中的定植及存活情況。結(jié)果:1、成功從正常與糖尿病患者脂肪組織中分離提取出ASCs,原代接種8小時后可見貼壁細胞,傳代后細胞生長明顯加速;兩種第3代細胞外形均一,多呈長梭形,呈放射樣旋渦狀生長,形態(tài)無明顯區(qū)別。流式細胞儀檢測兩種第三代細胞CD90、CD105、CD73、CD44均呈陽性表達,CD34均呈陰性表達。2、MTT法檢測細胞增殖能力結(jié)果顯示nASCs增殖能力較dASCs強,生長速度較快;誘導分化結(jié)果顯示nASCs與dASCs均可被誘導成脂及成骨,其中dASCs成脂能力強于nASCs,但成骨能力低于nASCs。實時定量PCR結(jié)果顯示誘導后dASCs脂肪特有基因PPAR-γmRNA的表達水平高于nASCs,而成骨基因骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)和骨鈣素(BGP)mRNA的表達水平低于nASCs,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.001)。3、成功建立小鼠背部皮膚壓瘡模型;行細胞移植后第5、9、13天nASCs組的創(chuàng)面愈合率分別為36.47±5.83%、89.18±2.14%、99.47±0.89%,dASCs組的為35.66±6.52%、60.40±7.67%、87.18±2.56,PBS組的為19.89±7.20%、46.32±4.21%、66.25±5.26%,nASCs組創(chuàng)面愈合最快,dASCs組愈合速度次之,PBS組創(chuàng)面愈合最慢。第11天取創(chuàng)面組織行HE染色結(jié)果顯示nASCs組開始出現(xiàn)上皮化,而dASCs組與PBS組創(chuàng)面表面痂皮與基底組織分離;在nASCs組、dASCs組及PBS組中炎性細胞浸潤程度依次遞減,組間差異具有統(tǒng)計學意義(P0.001)。第21天,炎性細胞浸潤程度在三組中無明顯區(qū)別;表皮厚度在nASCs組、dASCs組和PBS組依次遞減,組間差距具有統(tǒng)計學意義(P0.05);三組中創(chuàng)面周邊均可見再生的毛囊,其中dASCs創(chuàng)面中央可見新生毛囊。馬松染色結(jié)果顯示,第11天,dASCs組(48.38±1.36%)膠原沉積比nASCs組(45.85±1.95%)多,但無統(tǒng)計學意義;dASCs組和nASCs組膠原沉積明顯大于PBS組(41.46±1.75%),差異有統(tǒng)計學意義(P0.001)。第21天,nASCs組(56.93±1.67%)、dASCs組(54.17±1.71%)與PBS組(50.34±1.29%)膠原沉積依次遞減,組間差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。CD31免疫組化結(jié)果顯示,第11天,nASCs組(17.80±0.84)的血管數(shù)目與dASCs組(17.20±1.30)無顯著差別;但兩者血管數(shù)目均明顯大于PBS組(8.00±1.41),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.001)。第21天,血管數(shù)目在nASCs組(20.00±1.87)、dASCs組(18.00±2.12)及PBS組(14.00±1.58)中依次遞減,各組間差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。S100免疫組化結(jié)果顯示,第11天,nASCs組與dASCs組均未見陽性顯色細胞;第21天,nASCs組(1.63±0.08)的雪旺氏細胞密度小于dASCs組(1.76±0.12),但無統(tǒng)計學意義;nASCs組和dASCs組均明顯大于PBS組(0.55±0.04),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.001)。創(chuàng)面細胞追蹤結(jié)果為,第11天后nASCs與dASCs均可定植于創(chuàng)面皮膚內(nèi)。結(jié)論:1.和nASCs相比,dASCs的形態(tài)和表面標志無明顯變化,其增殖和成骨分化能力下降,而成脂分化能力增加。2.dASCs局部移植可通過調(diào)節(jié)局部炎癥、增加膠原沉積、促進血管新生和神經(jīng)再生促進壓瘡創(chuàng)面愈合。3.dASCs局部移植仍具備促進創(chuàng)面愈合的能力,但其能力較nASCs減小。
【圖文】：

遵義醫(yī)學院碩士學位論文 姚遠鎮(zhèn)2 結(jié)果2.1 ASCs 的的形態(tài)成功從正常與糖尿病患者脂肪組織中分離出 ASCs，原代接種 8 小時候可見貼壁細胞，48 小時換液后貼壁細胞形態(tài)不一；后細胞生長速度加快，大多細胞逐漸伸展成長梭形，細胞 9-10 天融合可達 80%-90%。傳代后細胞生長明顯加速，5 天左右即可再次傳代。兩組第 3 代細胞外形均一，多呈長梭形，呈放射樣旋渦狀生長，形態(tài)無明顯區(qū)別。如圖 1。

圖 2 第三代 nASCs 與 dASCs 流式鑒定結(jié)果 兩組細胞的 CD90、CD105、CD73、CD44 均呈陽性表達，CD34 均呈陰性表達。2.3 ASCs 的增殖能力采用 MTT 法檢測第 3 代細胞增殖能力并繪制生長曲線，結(jié)果顯示 nASCs 增殖能力較 dASCs 強，，生長速度較快。第 3 天前兩組細胞均處于生長停滯期，第 3 天到第 6天細胞處于對數(shù)增長期，但 nASCs 曲線斜率更大，第 6 天后逐漸進入平臺期。在相應(yīng)的時間點中，dASCs 的 OD 值均比 nASCs 的低。如圖 3。
【學位授予單位】：遵義醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R587.2

【參考文獻】

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本文編號：2708136