【摘要】：目的:系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種復(fù)雜的自身免疫疾病,具有較強(qiáng)的遺傳傾向,因此,其患病率和疾病特征性標(biāo)記在不同種族存在較大差異。SLE同卵雙胞胎和一級親屬的患病風(fēng)險為30~50%,是一般人群的20倍。在多米尼加共和國(Dominican Republic,DR)人群中,SLE的發(fā)病率和疾病的嚴(yán)重程度都顯著高于其他人群。迄今為止,有關(guān)多米尼加共和國人群SLE遺傳風(fēng)險因素的研究未見報道。SLE是過量的自身抗體及免疫復(fù)合物(immune complexes,ICs)沉積于組織所致。狼瘡腎炎(lupus nephritis,LN)是SLE患者最常見的并發(fā)癥之一,在SLE患者中的發(fā)病率約60%,其中,自身抗體是主要致病因素之一。盡管已經(jīng)確認(rèn)了多種SLE相關(guān)自身抗體,但至今仍未發(fā)現(xiàn)與SLE腎損害相關(guān)的自身抗體。本研究通過單核苷酸多態(tài)性分析鑒定多米尼加共和國人群中SLE的遺傳易感基因SNP,并通過相關(guān)分子生物學(xué)技術(shù)鑒定與SLE和LN疾病活動期相關(guān)的抗腎小球系膜細(xì)胞(mesangial cell,MC)組分的自身抗體,評估該自身抗體與LN、SLE活動期的相關(guān)性以及對MC凋亡的影響,為進(jìn)一步研究其在LN發(fā)病機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。研究方法:一、實驗材料1、研究對象:SLE、骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)患者和健康對照者來自于美國內(nèi)布拉斯加州大學(xué)醫(yī)學(xué)中心(University of Nebraska Medical Center,UNMC,Omaha,NE)、多米尼加共和國天主教大學(xué)(the Pontificia Universidad Católica Madre y Maestra PUCMM,Santiago De Los Caballeros,Dominican Republic)。SLE患者、狼瘡腎炎患者均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(American College of Rheumatology,ACR)相關(guān)國際分類標(biāo)準(zhǔn)。患者和健康者血清樣品均經(jīng)機(jī)構(gòu)審查委員會審定,并經(jīng)本人知情同意后采集。2、細(xì)胞系:腎小球系膜細(xì)胞(American Type Culture Collection,ATCC,Manassas,VA,美國)。3、抗體:抗14-3-3 eta山羊多克隆抗體購自Santa Cruz生物技術(shù)公司(Dallas,TX,美國);FITC標(biāo)記的驢抗人IgG、過氧化物酶標(biāo)記的驢抗人IgG以及過氧化物酶標(biāo)記的驢抗鼠IgG均購自美國Jackson免疫研究所。二、實驗方法1、基因型檢測:采用Sequenom’s MassARRAY IPLEX基因分型技術(shù)分析單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)2、重組抗體的制備:應(yīng)用單細(xì)胞PCR技術(shù)制備重組抗體3、細(xì)胞培養(yǎng)4、流式細(xì)胞儀篩選可與腎小球系膜細(xì)胞結(jié)合的重組抗體5、競爭實驗6、凋亡檢測7、免疫沉淀檢測8、質(zhì)譜測定9、Western blot檢測10、酶聯(lián)免疫吸附試驗11、統(tǒng)計學(xué)分析實驗結(jié)果:1、SNP分析結(jié)果表明,在SLE患者38個候選SNP中,9個非HLA基因(分別為ITGAM、BLK、TNFSF4、PTPN22、TNIP1、STAT4、CARD11和TNXB TNFAIP3);6個HLA基因(分別為HLA-DQA1、HLA-DRB2、HLA-DRA、HLA-DQA2、HLA-DRB1、HLA-DQB1)的19個SNP分布與對照組存在顯著性差異。HLA-DRA單體型A-T與LN有關(guān)且這種單體型在LN中存在基因劑量效應(yīng)。ITGAM的純合基因型“AA”與多米尼加人群LN顯著相關(guān)。HLA-DQA2rs2301271和TNFSF4 rs2205960中的“T”等位基因與NPSLE顯著相關(guān)且這兩個等位基因都有明顯的基因劑量效應(yīng)。2、經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測,利用單細(xì)胞RT-PCR技術(shù)合成的334個SLE重組抗體中有16個可與腎小球系膜細(xì)胞結(jié)合。3、應(yīng)用免疫沉淀結(jié)合質(zhì)譜技術(shù),從MC膜蛋白提取物中鑒定出三個可與16個MC特異結(jié)合的重組抗體結(jié)合蛋白質(zhì),分別是基底膜特異性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白多糖(basement membrane-specific heparan sulfate proteoglycan core protein,HSPG)、氨酰tRNA合成酶復(fù)合多功能相互作用蛋白1(aminoacyltRNA synthase complex-interacting multifunctional protein 1,AIMP1)和14-3-3eta。4、ELISA檢測結(jié)果顯示,16個可與MC結(jié)合的SLE重組抗體中,有5個(S3P1D11,S3P1F3,S3P1G9,S12P2D4和S12P2H9)可與14-3-3 eta蛋白結(jié)合,且吸光度值隨抗體濃度增加而增加,呈劑量依賴方式。5、Western blot檢測結(jié)果表明16個可與MC結(jié)合的SLE重組抗體中,有5個(S3P1D11,S3P1F3,S3P1G9,S12P2D4和S12P2H9)可與14-3-3 eta蛋白特異性結(jié)合。6、競爭實驗結(jié)果顯示,5個重組抗體(S3P1D11,S3P1F3,S3P1G9,S12P2D4和S12P2H9)與過量14-3-3 eta蛋白共同孵育后其與MC的反應(yīng)性部分或完全消失,表明14-3-3 eta介導(dǎo)或部分介導(dǎo)抗體與MC的結(jié)合。7、應(yīng)用ELISA方法檢測SLE組和健康對照組血清抗14-3-3 eta抗體滴度,結(jié)果顯示,不同地區(qū)SLE患者血清抗體水平較對照組均顯著升高(P0.0001,P=0.0003)。骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清抗14-3-3 eta抗體水平相似(P=0.8756),均顯著高于健康對照組(P=0.0012,P=0.0013),且均顯著低于SLE組(P=0.0027,P=0.0057)。SLE患者中,活動性腎炎組的抗體水平顯著高于無活動性腎炎組(P0.0001)。SLE患者中,抗14-3-3 eta抗體陽性者,其活動性腎炎發(fā)病率顯著高于抗體陰性者(P0.0001)。8、凋亡檢測結(jié)果顯示,用SLE來源的5個重組抗體(S3P1D11,S3P1F3,S3P1G9,S12P2D4和S12P2H9)或商品化抗體處理MC后,抗14-3-3 eta抗體使MC凋亡率下降,提示抗14-3-3 eta抗體可能通過誘導(dǎo)MC凋亡最終導(dǎo)致LN的發(fā)生。結(jié)論:1、在多米尼加人群中發(fā)現(xiàn)ITGAM、BLK、TNFSF4、PTPN22、TNIP1、STAT4、CARD11、TNXB TNFAIP3、HLA-DQA1、HLA-DRB2、HLA-DRA、HLA-DQA2、HLA-DRB1、HLA-DQB1基因的19個SNP為SLE易感SNP。同時,發(fā)現(xiàn)LN發(fā)病相關(guān)的高風(fēng)險性單體型HLA-DRA rs6937545-rs7763262,確定了HLA-DRA2和TNFSF4基因中的等位基因是NPSLE發(fā)生的遺傳危險因素。2、14-3-3 eta、HSPG和AIMP1是SLE的潛在自身抗原。3、抗14-3-3 eta抗體具有抑制腎小球系膜細(xì)胞凋亡的功能。4、抗14-3-3 eta抗體可能是LN和SLE疾病活動性判定的新的生物標(biāo)志物。
【圖文】：

圖2 ELISA實驗驗證SLE重組抗體與14-3-3 eta 蛋白的結(jié)合與陰性對照相比，，5個SLE重組抗體與14-3-3 eta 蛋白的反應(yīng)呈劑量依賴14-3-3 eta1 2 3 4 5 6 7 8圖3 Western blot實驗驗證SLE重組抗體與14-3-3 eta 蛋白的結(jié)合1. 陰性對照：只加二抗；2. 陰性對照：健康者的重組抗體；3. 陽性對照：商品化的羊抗14-3-3eta抗體；4. S3P1D11；5. S3P1F3；6. S3P1G9；7. S12P2D4；8. S12P2H9

圖5 SLE患者抗14-3-3 eta 抗體水平檢測結(jié)果A. UNMC來源血清抗14-3-3 eta抗體水平檢測結(jié)果；B. PUCMM來源血清抗14-3-3 eta抗體水平檢測結(jié)果。由于14-3-3 eta被認(rèn)為是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)的生物標(biāo)志物，為排除類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及其他關(guān)節(jié)炎可能造成的干擾，我們還檢測了骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)和RA患者血清抗14-3-3 eta 抗體滴度。如圖6所示，OA組血清抗14-3-3 eta抗體滴度均值為0.5416 (n=331, 95% CI: 0.4951-0.5881), RA組均值0.5598 (n=287，95% CI: 0.4964-0.6233), 二者水平近似，無顯著差異 (P=0.8756)。但OA組和RA組抗14-3-3 eta 抗體滴度均顯著高于健康對照組(OA: P=0.0012；RA：P=0.0013)，且均顯著低于SLE組 (OA：P=0.0027；RA：P=0.0057)。對照組 SLE 組對照組 SLE 組
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R593.241

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本文編號：2700360