發(fā)布時(shí)間：2020-06-06 02:26

【摘要】：背景:表觀遺傳學(xué)異常所致的免疫調(diào)控紊亂參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis,RA)的發(fā)生、發(fā)展。組蛋白乙�；揎検且环N在組蛋白賴氨酸殘基上進(jìn)行修飾的可逆的表觀遺傳學(xué)方式,通過組蛋白去乙�；�1(histone deacetylase1,HDAC1)和HDAC2從多方面調(diào)控并參與RA發(fā)病。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的微泡(human umbilical cord mesenchymal stem cells derived microvesicles,hUCMSC-MVs)可改善膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(Collagen-induced arthritis,CIA)大鼠關(guān)節(jié)癥狀及影像學(xué)表現(xiàn),抑制滑膜增生,下調(diào)促炎因子及趨化因子水平,且作用不弱于母體細(xì)胞。滑膜成纖維細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes,FLSs)作為RA病理過程中的核心靶細(xì)胞,對(duì)RA的關(guān)節(jié)炎癥及骨破壞起著關(guān)鍵作用。hUCMSC-MVs對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞(Rheumatoid Arthritis fibroblast-like synoviocytes,RA FLSs)功能的影響及作用機(jī)制尚不明確。目的:通過hUCMSC-MVs與RA FLSs體外共培養(yǎng),探討hUCMSC-MVs對(duì)RA FLSs增殖、凋亡、遷移功能及HDAC1、HDAC2表達(dá)的影響,闡明hUCMSC-MVs對(duì)RA FLSs的作用及可能的機(jī)制,從表觀遺傳學(xué)組蛋白乙酰化角度為hUCMSC-MVs治療RA提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:1.hUCMSC-MVs的分離、鑒定:復(fù)蘇hUCMSCs,培養(yǎng)傳代后取P3-P7代,“饑餓”培養(yǎng)24小時(shí),采用差速超速離心法提取上清液,獲得hUCMSC-MVs,透射電鏡觀察其形態(tài),并采用免疫印跡法(Western Blot)鑒定其表面分子標(biāo)志物。2.OA FLSs的分離、培養(yǎng)和鑒定:采用胰酶消化法體外分離、培養(yǎng)OA FLSs,倒置顯微鏡下觀察其形態(tài),并通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定其表面抗原CD90、CD14、CD45。3.hUCMSC-MVs與RA FLSs共培養(yǎng):觀察其對(duì)RA FLSs增殖、凋亡、遷移功能及HDAC1、HDAC2蛋白表達(dá)的影響。(1)實(shí)驗(yàn)分組:共4組,分別是OA FLSs組、RA FLSs組、曲古抑菌素A(TrichostatinA,TSA)組、hUCMSC-MVs組。(2)檢測(cè)指標(biāo):⑴CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖率,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移率;⑵Western Blot法測(cè)定hUCMSC-MVs干預(yù)前后RA FLSs中HDAC1、HDAC2表達(dá)的變化。結(jié)果:1.hUCMSC-MVs的分離和鑒定:透射電鏡觀察顯示離心所得產(chǎn)物為一類直徑介于40nm-300nm之間大小不一的囊泡狀結(jié)構(gòu),Western Blot鑒定分子表面標(biāo)志物,CD63、HSP70表達(dá)陽(yáng)性。2.OA FLSs的分離、鑒定:倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞呈渦旋狀分布,為長(zhǎng)梭形、紡錘樣外觀。流式細(xì)胞術(shù)鑒定分子表面標(biāo)志物,CD90陽(yáng)性表達(dá),CD14、CD45陰性表達(dá)。3.hUCMSC-MVs與RA FLSs體外共培養(yǎng):(1)hUCMSC-MVs對(duì)RA FLSs增殖功能的影響:hUCMSC-MVs組濃度分為10ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、150ug/ml、200ug/ml。1)與RA空白對(duì)照組比較,濃度為10ug/ml、50ug/ml、100ug/ml的hUCMSC-MVs組RA FLSs增殖率升高,濃度為150ug/ml、200ug/ml的hUCMSC-MVs組及TSA組RA FLSs增殖率下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。2)150ug/ml hUCMSC-MVs組與200ug/ml hUCMSC-MVs組FLSs增殖率無顯著差異(P0.05)。3)與TSA組相比,150ug/ml hUCMSC-MVs組、200ug/ml hUCMSC-MVs組RA FLSs增殖率升高,但無顯著差異(P0.05)。(2)hUCMSC-MVs對(duì)RA FLSs凋亡的影響:150 ug/ml hUCMSC-MVs組及TSA組FLSs凋亡率高于RA空白對(duì)照組,差異具有顯著性(P0.05)。與TSA組相比,hUCMSC-MVs組RA FLSs凋亡率升高,但無顯著差異(P0.05)。(3)hUCMSC-MVs對(duì)RA FLSs遷移功能的影響:在12h、24h時(shí),150 ug/ml hUCMSC-MVs干預(yù)組及TSA組RA FLSs遷移率低于RA空白對(duì)照組,差異具有顯著性(P0.05)。hUCMSC-MVs組RA FLSs遷移率高于TSA組,但無顯著差異(P0.05)。(4)hUCMSC-MVs對(duì)RA FLSs中HDAC1、HDAC2蛋白表達(dá)的影響:RA FLSs組HDAC1、HDAC2蛋白表達(dá)均高于OA FLSs組,差異具有顯著性(P0.05);與RA FLSs組相比,hUCMSC-MVs組HDAC1蛋白表達(dá)下降(P0.05),且作用不弱于TSA組。結(jié)論:hUCMSC-MVs可抑制RA FLSs的增殖、遷移能力,促進(jìn)其凋亡;HDAC1和HDAC2參與RA的發(fā)病;hUCMSC-MVs可下調(diào)RA FLSs中HDAC1的表達(dá),從組蛋白乙酰化角度抑制RA的發(fā)病。
【圖文】：

（2）Western Blot 檢測(cè) hUCMSC-MVs 表面分子標(biāo)志物的蛋白表達(dá)，，結(jié)果顯示CD63、HSP70 呈陽(yáng)性表達(dá)（見圖 3B）。圖3A hUCMSC-MVs透射電鏡圖圖3B Western Blot鑒定分子表面標(biāo)志物圖CD63、HSP70 表達(dá)陽(yáng)性

CD63、HSP70 呈陽(yáng)性表達(dá)（見圖 3B）。圖3A hUCMSC-MVs透射電鏡圖圖3B Western Blot鑒定分子表面標(biāo)志物圖CD63、HSP70 表達(dá)陽(yáng)性
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R593.22

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本文編號(hào)：2699002