【摘要】：目的:骨穩(wěn)態(tài)的平衡有賴于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間分化和功能的協(xié)調(diào)。破骨細(xì)胞作為唯一具有骨吸收功能的細(xì)胞,抑制破骨細(xì)胞的功能是治療骨質(zhì)疏松的策略之一。探究選擇性P38抑制劑帕吡莫德對雌激素缺乏導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的效果,并探究其潛在的機制,以期為臨床骨質(zhì)疏松的治療提供可選擇藥物。方法:利用帕吡莫德處理骨髓來源巨噬細(xì)胞,并誘導(dǎo)其分化:通過抗酒石酸酸性磷酸酶染色評估破骨細(xì)胞的生成;通過骨吸收實驗檢測帕吡莫德處理后破骨細(xì)胞骨吸收能力;通過免疫熒光實驗觀察帕吡莫德處理后相關(guān)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位情況;通過熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法分別檢測帕吡莫德處理后目標(biāo)基因在mRNA和蛋白水平的表達情況;通過小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)于體外沉默目標(biāo)基因,并觀察沉默后效果;通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)檢測轉(zhuǎn)錄因子和DNA的結(jié)合情況;通過小鼠切除卵巢誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松模型的構(gòu)建,評估帕吡莫德的治療效果。結(jié)果:帕吡莫德通過抑制P38的磷酸化和隨后的c-Fos、NFATcl(nuclear factor of activated T cells c1)的表達,抑制 RANKL(receptor activator of nuc 丨 ear factor-Kb ligand,RANKL)誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成。破骨細(xì)胞標(biāo)記基因c-Fos、NFATc1、CTSK、TRAP等表達量也都下降。并隨著帕吡莫德劑量的提高和處理時間的延長,其抑制效果而更加明顯。另外,PAM導(dǎo)致的NFATc1表達的下調(diào),使NFATc1靶基因ADAM12(disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 12)表達下降。ADAM12沉默后,破骨細(xì)胞分化能力未受影響,但破骨細(xì)胞骨吸收能力下降。帕吡莫德對成骨細(xì)胞的分化沒有明顯的影響。PAM對卵巢切除誘導(dǎo)的小鼠骨質(zhì)疏松模型骨量丟失具有保護作用。結(jié)論:帕吡莫德能通過抑制P38/NFATc1軸抑制破骨細(xì)胞的生成,并通過抑制NFATc1/ADAM12抑制破骨細(xì)胞骨吸收。
【圖文】：

Ｄｍｅ邐Ｔｉｍｅ邐Ｎ．邋Ｎｕｃｌｅｉ逡逑圖１邋ＰＡＭ抑制ＲＡＮＫＬ誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成逡逑（Ａ）邋ＰＡＭ的分子結(jié)構(gòu)；（Ｂ）通過ＣＣＫ－８檢測ＰＡＭ對ＢＭＭｓ增殖的影響；（Ｃ，Ｄ）逡逑不同濃度ＰＡＭ對破骨細(xì)胞生成的影響和對破骨細(xì)胞的數(shù)量、面積和按細(xì)胞核數(shù)目逡逑進行的破骨細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計；（Ｅ，Ｆ）邋６４ｎＭＰＡＭ對破骨細(xì)胞不同分化階段的影響和對破逡逑

３．１邋ＰＡＭ抑制ＲＡＮＫＬ誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成逡逑我們首先分別檢測了邋ＰＡＭ在４８ｈ和９６ｈ對小鼠原代骨髓巨噬細(xì)胞（ＢＭＭｓ）逡逑的細(xì)胞毒性效應(yīng)。如圖１邋Ｂ所示，，在ＰＡＭ濃度為５｜ｎＭ時，沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性。為了逡逑探討ＰＡＭ是否會影響ＲＡＮＫＬ誘導(dǎo)的體外破骨細(xì)胞形成，在Ｍ－ＣＳＦ、ＲＡＮＫＬ的逡逑處理下，分別在ＰＡＭ濃度為１６ｎＭ、３２ｎＭ和６４ｎＭ劑量下處理ＢＭＭｓ。可以看到，逡逑在３２ｎＭ的濃度下，ＰＡＭ明顯抑制破骨細(xì)胞的生成，在１２８ｎＭ濃度時僅有少數(shù)的逡逑成熟破骨細(xì)胞生成（圖１Ｃ）。成熟破骨細(xì)胞數(shù)量和破骨細(xì)胞面積呈ＰＡＭ濃度依賴性逡逑下降。與對照姐相比，６４邋ｎＭ組成熟破骨細(xì)胞的大小和成熟破骨細(xì)胞的核數(shù)量明顯逡逑減少（圖１Ｄ）。為了更好地理解ＰＡＭ在破骨細(xì)胞分化過程中的抑制作用，我們在破逡逑骨細(xì)胞形成過程中，于不同時間點的破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加了邋６４ｎＭＰＡＭ。逡逑如圖１Ｅ所示，在破骨細(xì)胞分化的早期（第１－３天），ＰＡＭ的加入顯著抑制了破骨細(xì)逡逑胞的形成。在破骨細(xì)胞分化中期（第３－５天）添加ＰＡＭ
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R580

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本文編號：2697776