【摘要】：研究背景糖尿病潰瘍是一種嚴重的慢性難愈合性創(chuàng)面,常導致患者截肢甚至死亡,給患者及其家庭造成極大的損傷。近年來,干細胞用于組織修復的研究越來越多。脂肪組織來源的間充質(zhì)干細胞(Adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)具有來源廣泛、容易獲得的優(yōu)點,ADSCs能夠加速創(chuàng)面愈合并減少瘢痕增生,特別是對于慢性創(chuàng)面,使用傳統(tǒng)的治療方法病人無法痊愈,ADSCs為這些患者帶來了希望。糖尿病潰瘍創(chuàng)面相比正常創(chuàng)面在炎癥階段的時間更長,產(chǎn)生大量炎癥細胞因子,使糖尿病潰瘍難以愈合。巨噬細胞在慢性創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,其中M1型巨噬細胞分泌產(chǎn)生促炎細胞因子(如IL-1β、TNF-α、IL-6等)、一氧化氮、蛋白酶和宿主防御活性氧,抑制組織損傷修復;M2型巨噬細胞分泌產(chǎn)生抗炎因子(IL-10等)、鳥氨酸和多胺,緩解炎癥反應(yīng),促進組織損傷修復;在慢性創(chuàng)面中巨噬細胞長期呈現(xiàn)M1表型,釋放炎癥因子導致組織損傷不能愈合。在調(diào)節(jié)巨噬細胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)化的研究中,IL-10因其強大的抗炎功能而受到研究者和臨床醫(yī)生的特別關(guān)注,IL-10雖能有效的降低炎癥,但其在創(chuàng)面的半衰期僅有2h左右,如何在慢性創(chuàng)面延長其發(fā)揮作用是一個需要解決的問題。目前大部分研究單獨應(yīng)用ADSCs促進創(chuàng)面愈合,還有些研究將ADSCs與生物材料相結(jié)合或者采用ADSCs的條件培養(yǎng)基或濃縮物(凍干粉)促進創(chuàng)面的愈合,也有研究將ADSCs與抗炎因子相結(jié)合,抑制慢性創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)從而加速創(chuàng)面的愈合。我們的研究擬通過基因工程技術(shù)在ADSCs中過表達IL-10,將ADSC-IL10移植到糖尿病小鼠創(chuàng)面上,利用IL-10促進M2巨噬細胞轉(zhuǎn)化的作用,聯(lián)合ADSCs實現(xiàn)糖尿病潰瘍創(chuàng)面的快速愈合。研究目的1.檢測ADSCs過表達IL-10(簡稱ADSC-IL10)對ADSCs生物學特性的影響;2.明確ADSC-IL10促進糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合的有效性;3.探討ADSC-IL10促進糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合的機制。研究方法1.過表達IL-10對ADSCs生物學特性的影響(1)利用慢病毒將編碼小鼠IL-10蛋白的基因整合到人ADSCs細胞中;(2)利用ELISA試劑盒檢測ADSC-IL10體外培養(yǎng)上清中IL-10蛋白的表達量;(3)利用流式細胞學技術(shù)分析ADSC-IL10的表面干細胞標志物(CD44、CD73、CD90、CD105);(4)采用細胞劃線法、MTT法檢測ADSC-IL10的遷移和增殖能力;(5)將ADSC-IL10向成脂和成骨細胞方向誘導分化,采用熒光實時定量PCR技術(shù)檢測成脂標志基因PPARγ和成骨標志基因RUNX2的表達量。2.ADSC-IL10條件培養(yǎng)基對創(chuàng)傷修復相關(guān)細胞的作用(1)采用 ADSC-IL10 條件培養(yǎng)基(ADSC-IL10-CM)和 ADSC-PCDH 的條件培養(yǎng)基(ADSC-CM)培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細胞(Raw 264.7),同時以DMEM低糖培養(yǎng)基作為對照。培養(yǎng)12h后,收集Raw 264.7細胞提取mRNA,采用qPCR技術(shù)檢測Raw 264.7細胞類型,其中M1型通過CD86判斷,M2型通過Arg-1、CD206判斷;采用qPCR技術(shù)檢測IL-1β、IL-6、IL-10、MCP-1等炎癥因子以及EGF、VEGF、TGFβ-1等生長因子的表達量。(2)采用transwell的方法檢測ADSC-IL10-CM和ADSC-CM對正常皮膚成纖維細胞遷移的影響;采用劃線法檢測ADSC-CM對人永生化的表皮細胞的遷移的影響。3.移植ADSC-IL10促進糖尿病小鼠創(chuàng)面的愈合及機制的研究(1)采用高脂高糖飲食+鏈脲佐菌素(STZ;150mg/kg,腹腔注射1次)誘導糖尿病小鼠模型,糖尿病小鼠模型(隨機血糖高于16.7 mmol/L)誘導成功15天后,選取45只的高血糖小鼠納入研究。(2)將45只高血糖小鼠納隨機分為對照組、ADSC-PCDH組和ADSC-IL10組,每組15只。在小鼠背部1.5cm×1.5cm創(chuàng)面,ADSC-IL10組創(chuàng)面移植1×106個ADSC-IL10細胞,ADSC-PCDH組移植1×106個ADSC-PCDH,對照組移植等體積的0.9%的生理鹽水。在不同時間點觀察小鼠創(chuàng)面愈合情況并拍照記錄。(3)分別取第3天和第7天的小鼠創(chuàng)面組織進行組織學染色和qPCR。組織學染色主要通過HE染色觀察創(chuàng)面愈合狀況,免疫熒光(CD206、Arg-1)鑒定小鼠皮膚組織中M2型巨噬細胞數(shù)量;qPCR檢測CD206、Arg-1基因的表達量鑒定創(chuàng)傷組織中巨噬細胞類型;檢測IL-1β、IL-6、IL-10、MCP-1等炎癥因子判斷創(chuàng)傷組織的炎癥狀態(tài);檢測EGF、VEGF、TGFβ-1生長因子在創(chuàng)傷組織中的表達量。研究結(jié)果1、ADSC過表達IL-10對ADSCs細胞生物學特性的影響(1)ADSC-IL10、ADSC-PCDH和ADSCs細胞上清中IL-10的濃度分別為8245±294.6 pg/ml、358.7±30.36 pg/ml 和 342.8±13.64 pg/ml,ADSC-IL10 細胞上清中IL-10的含量相比ADSC-PCDH和ADSCs顯著升高。(2)ADSC-IL10、ADSC-PCDH 和 ADSCs 的干細胞標志物 CD44、CD73、CD90、CD105均陽性表達,相互之間未見明顯差異。(3)ADSC-IL10、ADSC-PCDH和ADSCs組的細胞均在24h時完成遷移,細胞遷移的距離和數(shù)量沒有顯著差異。(4)ADSC-IL10、ADSC-PCDH和ADSCs組的細胞成脂分化誘導7天,脂滴的形成和油紅O染色沒有顯著性差異,成脂標志基因PPARγ的表達在三組之間沒有顯著性差異。ADSC-IL10、ADSC-PCDH和ADSCs組的細胞成骨分化誘導21天,茜素紅染色未見顯著差異,成骨標志基因RUNX2的表達在三組之間沒有顯著性差異。2、ADSC-IL10-CM對創(chuàng)傷修復相關(guān)細胞的作用(1)采用ADSC-IL10-CM培養(yǎng)Raw 264.7細胞,結(jié)果顯示Raw 264.7細胞在體外試驗中Arg-1和CD206高表達。促炎因子IL-1β、IL-6、MCP-1低表達,抑炎因子IL-10高表達;Raw 264.7細胞在ADSC-IL10-CM中高表達生長因子EGF、TGFβ-1、VEGF。說明Raw 264.7細胞在ADSC-IL10-CM的作用下向M2型分化,炎癥因子的表達量下降,生長因子的表達量上升。(2)ADSC-IL10-CM組和ADSC-CM組與對照組相比能夠促進皮膚成纖維細胞的遷移;ADSC-IL10組比ADSC-PCDH組成纖維細胞遷移的數(shù)量更多。ADSC-CM促進人永生化的表皮細胞的遷移。3、移植ADSC-IL10促進糖尿病小鼠創(chuàng)面的愈合及機制(1)ADSC-IL10組糖尿病小鼠愈合速度(19天愈合)明顯高于ADSC-PCDH組(21天愈合)和對照組(25天愈合)。采用imageJ統(tǒng)計三組間在不同時段的愈合面積,結(jié)果顯示ADSC-IL10組愈合面積明顯高于ADSC-PCDH組和對照組,且存在統(tǒng)計學差異。(2)通過對CD206進行的免疫熒光染色顯示第3天小鼠皮膚組織M2型巨噬細胞并無明顯差異。第7天時,免疫熒光顯示ADSC-IL-10組創(chuàng)傷組織中Arg-1和CD206的表達量高于ADSC-PCDH組,且ADSC-PCDH組高于對照組;qPCR檢測組織中Arg-1和CD206的表達量也顯示了同樣的結(jié)果。提示M2型巨噬細胞在ADSC-IL-10組創(chuàng)面組織中的含量增加。(3)與對照組相比,移植ADSC-IL10組糖尿病小鼠創(chuàng)面促炎因子IL-1β的表達量下降,抑炎因子IL-4R、IL-10表達量上升;生長因子EGF、TGFβ-1、VEGF的表達量上升。提示移植ADSC-IL10組小鼠炎癥反應(yīng)下降,生長因子表達量上升。研究結(jié)論綜上,我們的研究表明過表達IL-10不會影響ADSCs細胞的生物學特性,在小鼠糖尿病創(chuàng)面中移植ADSC-IL10相比單獨ADSCs移植能更快促進糖尿病小鼠創(chuàng)面的愈合。ADSC-IL10加速創(chuàng)面愈合的機制可能包括以下方面相關(guān):ADSC-IL10促進糖尿病小鼠創(chuàng)面M2型巨噬細胞的表達,抑制IL-11β、IL-6、MCP-1等促炎因子的分泌,并促進EGF、TGFβ-1、VEGF生長因子的表達,促進創(chuàng)面皮膚成纖維細胞和表皮細胞的遷移。
【圖文】：

鏡下觀察分離純化的脂肪間充質(zhì)干細胞，發(fā)現(xiàn)其大部分在２４ｈ時內(nèi)己經(jīng)貼壁，逡逑細胞邊境清晰、呈紡錘形，有小的胞漿突起，原代細胞培養(yǎng)５天左右細胞能夠完全逡逑融合，，生長狀態(tài)良好。（圖１．１）我們采用的ＡＤＳＣ細胞均為Ｐ５代之內(nèi)的細胞。逡逑釃歫逡逑圖１．１原代ＡＤＳＣｓ和Ｐ４代ＡＤＳＣｓ細胞形態(tài)逡逑（Ａ）原代ＡＤＳＣｓ細胞，細胞較小，上部漂浮少量的油脂；（Ｂ）邋Ｐ４代ＡＤＳＣｓ細胞，己生逡逑長至９５％以上，此時的細胞可進行傳代培養(yǎng)。圖中標尺長度為ｌＯＯｕｍ。逡逑采用流式細胞學技術(shù)對提取的Ｐ３代ＡＤＳＣｓ進行干細胞標志物（ＣＤ４４、ＣＤ７３、逡逑）g汗０和〔ゞ罕０５）尖Iǎ嘭峁銃允荊�？３�

本文編號：2695570