【摘要】：目的:自身免疫性甲狀腺炎(Autoimmune thyroiditis,AIT)是一種常見(jiàn)的自身免疫性疾病,其中橋本甲狀腺炎(Hashimoto thyroiditis,HT)是AIT的主要類型。HT患者具有遺傳易感性且存在受環(huán)境因素影響的免疫缺陷,表現(xiàn)為甲狀腺內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和濾泡組織損傷,血清中存在甲狀腺的循環(huán)抗體,主要是抗甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體(Antithyroid peroxidase antibodies,TPOAb)和甲狀腺球蛋白抗體(Thyroglobulin antibodies,TgAb),可導(dǎo)致甲狀腺纖維化或萎縮,并伴有甲狀腺功能減退癥。Th17細(xì)胞是T helper(Th)細(xì)胞家族成員之一,主要分泌以IL-17a為代表的細(xì)胞因子,近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)Th17參與多種自身免疫性疾病的發(fā)生與發(fā)展,包括多發(fā)性硬化(MS)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和1型糖尿病(T1DM)等。AIT中存在Th17細(xì)胞表達(dá)異常,但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步的深入研究。MicroRNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源性單鏈非編碼高度保守的小RNA分子,主要是通過(guò)與靶mRNAs的3’端非編碼區(qū)結(jié)合,導(dǎo)致靶mRNAs降解和(或)翻譯抑制,在免疫系統(tǒng)發(fā)育和調(diào)節(jié)機(jī)制中發(fā)揮重要作用。目前AIT的發(fā)病機(jī)制尚未明確,有關(guān)miRNAs在AIT中的研究亦較少。本研究前期已經(jīng)在AIT的模型小鼠NOD.H-2h4小鼠的甲狀腺和脾臟以及HT患者PBMC和甲狀腺組織中發(fā)現(xiàn)miR-326的水平明顯升高。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)使用小干擾RNA抑制劑(miR-326 inhibitor)和慢病毒編碼miR-326 sponge(LV-sponge)特異性抑制miR-326使miR-326水平下調(diào)后,研究在AIT中miR-326是否通過(guò)靶向調(diào)節(jié)Ets-1蛋白和ADAM17參與Th17的分化,從而減輕自身免疫甲狀腺炎的發(fā)病及炎癥程度,為自身免疫性甲狀腺炎的發(fā)病機(jī)制及治療研究提供新的理論基礎(chǔ)。研究方法:1、HT患者實(shí)驗(yàn)研究:本研究第一部分以HT患者為研究對(duì)象,收取因甲狀腺癌或結(jié)節(jié)性甲狀腺腫行甲狀腺手術(shù)的患者的(對(duì)側(cè)葉或結(jié)節(jié)旁)甲狀腺組織,根據(jù)其甲狀腺病理結(jié)果及甲狀腺功能分為橋本病組(HT組,n=24)和非橋本病對(duì)照組(n=29)。同時(shí)收取橋本病患者(n=31)及健康志愿者對(duì)照(n=23)外周血,分離PBMC及血清和血漿。檢測(cè)PBMC和甲狀腺組織中Ets-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平,并將Ets-1蛋白與TPOAb、TgAb、miR-326和Th17 mRNA水平做相關(guān)性分析。2、AIT動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)研究:利用siRNA和慢病毒在體外和體內(nèi)分別探究了抑制miR-326后免疫細(xì)胞及炎癥因子的變化。首先,體外實(shí)驗(yàn)中,將小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行Th17細(xì)胞極化培養(yǎng)3天后,使用miR-326 inhibitor抑制miR-326,檢測(cè)Th17細(xì)胞比率和IL-17水平。其次,LV-sponge和慢病毒對(duì)照(LV-ctrl)給予小鼠體內(nèi)干預(yù)實(shí)驗(yàn)。將5周齡NOD.H-2h4小鼠分為2大組,分別為尾靜脈注射組和甲狀腺局部注射組。尾靜脈注射組分為5小組進(jìn)行干預(yù):單純高碘組(High iodine)、高碘治療對(duì)照組(High iodine+the LV-ctrl)、高碘治療組(High iodine+the LV-sponge)、高碘預(yù)防對(duì)照組(High iodine+pro LV-ctrl)和高碘預(yù)防組(High iodine+pro LV-sponge)。預(yù)防及預(yù)防對(duì)照組在小鼠5周齡開(kāi)始給予碘化鈉(NaI)飲水的同時(shí)行慢病毒干預(yù),治療與治療對(duì)照組在小鼠5周齡開(kāi)始給予NaI飲水滿6周后行慢病毒干預(yù)。5組小鼠均在NaI飲水滿12周時(shí)處死,留取血清和甲狀腺等組織。甲狀腺局部注射組分為L(zhǎng)V-sponge和LV-ctrl兩組,小鼠均在NaI飲水滿10周時(shí)處死,留取血清和甲狀腺等組織。檢測(cè)小鼠血清TgAb水平,評(píng)價(jià)小鼠炎癥狀態(tài)。新鮮脾臟進(jìn)行流式染色,檢測(cè)T細(xì)胞、B細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞(Th)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Tc),并檢測(cè)Th1、Th2、Th17、Treg亞群比例。脾臟提取總RNA,一方面檢測(cè)miR-326的表達(dá)變化,用以判定抑制效果;另一方面檢測(cè)Ets-1、Th17相關(guān)細(xì)胞因子(IL-17a和IL-22)、轉(zhuǎn)錄因子(Rorgt、Rora和Irf4等)和表面受體(CCR6和IL-23R)等。提取脾臟蛋白,檢測(cè)Ets-1和ADAM17的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果:1、HT患者實(shí)驗(yàn)研究:與對(duì)照人群相比,HT患者甲狀腺組織和外周血PBMC中Ets-1 mRNA水平?jīng)]有差異,而Ets-1蛋白表達(dá)明顯降低,P值分別為P=0.034和P=0.009。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),Ets-1蛋白的相對(duì)表達(dá)與miR-326和Th17mRNA水平呈顯著負(fù)相關(guān)。2、動(dòng)物體外實(shí)驗(yàn):與陰性對(duì)照組相比,Th17細(xì)胞比率在miR-326 inhibitor組中顯著降低,培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-17水平亦是顯著降低,(P0.05)。3、動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究:尾靜脈注射組1)與單純高碘和高碘LV-control組相比,高碘LV-sponge組miR-326水平明顯降低,說(shuō)明慢病毒尾靜脈干預(yù)抑制miR-326作用有效。2)5組高碘喂養(yǎng)12周的小鼠T細(xì)胞、B細(xì)胞、Th細(xì)胞和Tc細(xì)胞比例無(wú)差異。3)與單純高碘和高碘LV-control組相比,高碘LV-sponge組甲狀腺HE染色炎癥評(píng)分和血清TgAb滴度下降明顯。4)小鼠脾臟Ets-1蛋白在高碘LV-sponge組中表達(dá)升高,且在治療組中升高明顯,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.039),而Ets-1 mRNA水平在5組中無(wú)明顯差異。5)小鼠脾臟ADAM17在高碘LV-sponge組表達(dá)相對(duì)升高,而IL-23R蛋白表達(dá)則顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,(P0.05)。6)高碘喂養(yǎng)12周小鼠的Th1和Th2細(xì)胞比率在5組中的比例無(wú)顯著差異;Treg細(xì)胞比率在高碘預(yù)防組中增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.047);Th17細(xì)胞比率在高碘治療組有下降趨勢(shì),在高碘預(yù)防組中顯著下降(P=0.042);Th17/Treg比值在高碘預(yù)防組中顯著下降(P=0.005)。Th17相關(guān)細(xì)胞因子IL-17a、IL-22,轉(zhuǎn)錄因子Rorgt、Rora和表面受體CCR6、IL-23R在LV-sponge中顯著下降(P0.05)。4、動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn):甲狀腺局部注射組1)與高碘LV-control組相比,高碘LV-sponge組小鼠甲狀腺HE染色炎癥評(píng)分和血清TgAb滴度水平顯著下降(P0.05)。2)高碘LV-control組和高碘LV-sponge組小鼠脾臟miR-326水平無(wú)明顯差異(P=0.239)。結(jié)論:1、HT患者甲狀腺組織和PBMC中Ets-1蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組,而Ets-1 mRNA水平無(wú)明顯差異。Ets-1蛋白相對(duì)表達(dá)與miR-326和Th17 mRNA顯著負(fù)相關(guān),提示miR-326對(duì)Ets-1可能具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。2、AIT動(dòng)物模型小鼠在體干預(yù)發(fā)現(xiàn),miR-326在體慢病毒抑制不影響T細(xì)胞、B細(xì)胞、Th細(xì)胞和Tc細(xì)胞平衡。抑制miR-326后,小鼠血清TgAb滴度下降,Ets-1蛋白表達(dá)升高,Ets-1 mRNA水平無(wú)明顯變化,且Th17細(xì)胞比率及Th17細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子和表面受體表達(dá)下降,進(jìn)一步明確了miR-326通過(guò)靶向調(diào)節(jié)Ets-1蛋白影響Th17細(xì)胞的分化參與自身免疫甲狀腺炎。
【圖文】：

圖 1.1 甲狀腺組織和外周血 PBMC 中 Ets-1 mRNA 的水平3.1.3 甲狀腺組織中 Ets-1 蛋白相對(duì)表達(dá)與對(duì)照組患者相比，HT 患者甲狀腺組織中 Ets-1 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.034）。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，Ets-1 蛋白相對(duì)表達(dá)量與 miR-326 水平和 IL-17 mRNA 水平均呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.466，p=0.003 和 r=-0.43，p=0.007），與 TPOAb、TgAb 有負(fù)相關(guān)趨勢(shì)（如圖 1.2 所示）。GAPDHEts-1Control HT

圖 1.2 甲狀腺組織中 Ets-1 蛋白相對(duì)表達(dá)及相關(guān)性分析3.1.4 PBMC 中 Ets-1 蛋白相對(duì)表達(dá)與健康對(duì)照者相比，HT 患者外周血 PBMC 中 Ets-1 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009）。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，Ets-1 蛋白相對(duì)表達(dá)量與 miR-326水平和 IL-17 mRNA 水平均呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.618，，p=0.008 和 r=-0.645，p=0.004）。與 TgAb 呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.49，p=0.046）。與 TPOAb 有負(fù)相關(guān)趨勢(shì)（r=-0.438，p=0.067），見(jiàn)圖 1.3 所示。GAPDHEts-1Control HT
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R581.4

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 劉詠萍;MicroRNA-326調(diào)節(jié)ADAM17促進(jìn)Th17細(xì)胞分化參與橋本甲狀腺炎發(fā)病的研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2693575