【摘要】：研究目的:骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis)是常見的骨代謝性疾病,以骨密度降低、微結(jié)構(gòu)破壞和骨脆性增加為主要臨床病理特征。隨著我國(guó)人口老齡化進(jìn)程,骨質(zhì)疏松癥的患病率持續(xù)上升,嚴(yán)重危害人類健康。破骨細(xì)胞數(shù)量和(或)功能的異常是骨質(zhì)疏松癥的重要病理機(jī)制。RANKL/RANK/OPG是破骨細(xì)胞分化最重要的調(diào)節(jié)因子/受體,其通過 NF-κB(nuclear factor-kappa B),MAPKs(mitogen-activated protein kinases)等信號(hào)通路參與破骨細(xì)胞增殖、分化和成熟等調(diào)控。FKBP51屬于親免素蛋白家族中的一員,具有復(fù)雜廣泛的細(xì)胞生物學(xué)作用,它在應(yīng)激、腫瘤、激素依賴性疾病、生殖、脂質(zhì)代謝和免疫等方面均發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,FKBP51還參與調(diào)控NF-κB與AKT等信號(hào)通路。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)FKBP51V55L突變可以增強(qiáng)破骨細(xì)胞分化及功能而參與Paget骨病的發(fā)生、發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)RA(rheumatoid arthritis)患者破骨細(xì)胞前體細(xì)胞內(nèi)FKBP51 mRNA表達(dá)水平明顯增高,另外通過上調(diào)FKBP51的表達(dá)發(fā)現(xiàn)FKBP51促進(jìn)了破骨細(xì)胞的分化與成熟,但分子機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探究FKBP51對(duì)破骨細(xì)胞分化的作用及機(jī)制,為骨質(zhì)疏松癥的防治提供新的方向。研究方法:1.FKBP51對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響:RAW264.7細(xì)胞感染FKBP51慢病毒或轉(zhuǎn)染敲減質(zhì)粒,建立FKBP51細(xì)胞過表達(dá)或敲減細(xì)胞模型;細(xì)胞用50ng/ml RANKL因子誘導(dǎo)2-3天,進(jìn)行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,計(jì)數(shù)TRAP染色陽(yáng)性且細(xì)胞核≥3個(gè)的多核細(xì)胞,分析FKBP51對(duì)RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的影響。2.RT-PCR:通過RT-PCR檢測(cè)破骨細(xì)胞分化標(biāo)志性分子CTR,CTSK,OSCAR和破骨細(xì)胞分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子c-Fos,NFATc1,PU.1,MITF,TRAF6,Blimp1的mRNA表達(dá)水平,進(jìn)一步在分子水平上驗(yàn)證FKBP51對(duì)RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的作用。3.Western blot:利用Western blot分析破骨細(xì)胞分化關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子c-Fos和NFATcl的蛋白表達(dá)水平;檢測(cè)破骨細(xì)胞分化相關(guān)的AKT,NF-κB和MAPKs(包括P38,JNK,ERK)信號(hào)通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平,探索FKBP51調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的作用機(jī)制。結(jié)果:1.FKBP51過表達(dá)與敲減模型的建立:慢病毒感染組FKBP51的蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P0.05);質(zhì)粒敲減組FKBP51的蛋白表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(P0.05),即成功構(gòu)建FKBP51過表達(dá)與敲減細(xì)胞模型。2.FKBP51促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞的分化:在RANKL因子的誘導(dǎo)下,FKBP51過表達(dá)組破骨細(xì)胞的數(shù)目明顯多于對(duì)照組(P0.05),FKBP51敲減組破骨細(xì)胞的數(shù)目明顯低于對(duì)照組(P0.05),表明FKBP51促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞的分化。3.FKBP51過表達(dá)促進(jìn)破骨細(xì)胞分化標(biāo)志性分子的表達(dá):與對(duì)照組相比,FKBP51過表達(dá)細(xì)胞破骨細(xì)胞標(biāo)志性分子CTSK,CTR和OSCAR的mRNA表達(dá)水平升高(P0.05),在分子水平上證明FKBP51過表達(dá)促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞的分化。4.FKBP51過表達(dá)上調(diào)破骨細(xì)胞分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá):FKBP51過表達(dá)細(xì)胞及對(duì)照經(jīng)RANKL誘導(dǎo)后,其分化過程中的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子c-Fos和NFATcl早期的蛋白與mRNA表達(dá)水平均升高(P0.05),其他相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子TRAF6,MITF,PU.1和BLIMP1的mRNA表達(dá)水平也升高(P0.05)。5.FKBP51參與調(diào)控AKT、NF-κB、MAPKs信號(hào)通路:Western blot結(jié)果顯示,FKBP51過表達(dá)下調(diào)AKT Ser473位點(diǎn)的磷酸化水平,而Thr308位點(diǎn)的磷酸化水平無(wú)明顯差異;FKBP51過表達(dá)激活了 NF-κB,MAPKs(P38,特別是JNK,ERK)信號(hào)通路(P0.05)。結(jié)論:FKBP51可能通過激活NF-κB,MAPKs信號(hào)通路上調(diào)破骨細(xì)胞分化關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子c-Fos和NFATc1的表達(dá),進(jìn)而上調(diào)破骨細(xì)胞標(biāo)志性分子CTR,CTSK和OSCAR等的表達(dá),促進(jìn)破骨細(xì)胞分化。
【圖文】：

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邐山東大學(xué)碩士學(xué)位論文ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ邋ｇｒｏｕｐ邋ｏｆ邋ＦＫＢＰ５１邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ，邋ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ邋ｆｏｒ邋２－３邋ｄＴｈｅｎ，，邋ＴＲＡＰ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｗａｓ邋ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ邋ｔｏ邋ｃｏｕｎｔ邋ｃｅｌｌｓ邋ｗｉｔｈ邋ＴＲＡＰ＋邋ａｎｄ邋ｎｕｃｌｅｕｓ＾３，ｔｈｅ邋ｎｕｍｂｅｒ邋ｏｆ邋ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｓ邋ｗａｓ邋ｃｏｍｐａｒｅｄ．邋ＣＰ邋＜邋０．０５）逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R580

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本文編號(hào)：2693511