發(fā)布時間：2020-06-01 16:45

【摘要】：研究目的:近年來糖尿病發(fā)病率逐年增加,已成為嚴重威脅公眾健康的疾病之一。糖尿病引起的中樞損傷即糖尿病相關性認知障礙也逐漸受到關注。胰島素抵抗作為糖尿病的重要發(fā)病機制之一,參與了糖尿病相關并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。研究表明糖尿病相關性認知障礙的發(fā)生發(fā)展與中樞胰島素抵抗關系密切。然而,現(xiàn)階段中樞胰島素抵抗對神經(jīng)元形態(tài)與功能影響的相關研究較少,中樞胰島素抵抗引起糖尿病相關性認知障礙的具體機制也尚不明確。生理情況下,神經(jīng)元-星形膠質細胞間的代謝偶聯(lián)對學習、認知及記憶形成等過程至關重要,但中樞胰島素抵抗情況下神經(jīng)元-星形膠質細胞間代謝偶聯(lián)的變化尚不清楚。基于此,本研究擬建立神經(jīng)元-星形膠質細胞共培養(yǎng)體系下的胰島素抵抗模型,觀察中樞胰島素抵抗對神經(jīng)元形態(tài)與功能的影響,并探討神經(jīng)元-星形膠質細胞間代謝偶聯(lián)在中樞胰島素抵抗引起神經(jīng)元損傷中的作用;之后,我們選用可以改善胰島素抵抗的降糖藥物進行干預,觀察降糖藥物對上述神經(jīng)元損傷及神經(jīng)元-星形膠質細胞間代謝偶聯(lián)的改善作用。研究方法:⑴采用改良的“三明治式”共培養(yǎng)方法建立神經(jīng)元-星形膠質細胞共培養(yǎng)體系,以模擬機體中樞部位神經(jīng)細胞微環(huán)境,比較共培養(yǎng)體系與非共培養(yǎng)體系下神經(jīng)元形態(tài)及細胞活性差異;并利用胰島素、葡萄糖、棕櫚酸三種方法進行胰島素抵抗模型的探索,通過MTT方法等觀察三種造模方法對神經(jīng)元的影響,尋找共培養(yǎng)體系下胰島素抵抗的最佳方法;通過western blot檢測胰島素信號通路相關蛋白水平進行中樞胰島素抵抗的驗證與評價;⑵通過HE染色,尼氏染色等方法觀察胰島素抵抗對共培養(yǎng)體系下神經(jīng)元形態(tài)學的影響;通過熒光及流式細胞術檢測和評估神經(jīng)元的凋亡情況;通過western blot方法檢測神經(jīng)元突觸可塑性蛋白表達情況以評價突觸功能;通過β半乳糖苷酶染色、端粒酶活性檢測及衰老相關蛋白Sirt1蛋白表達情況評估神經(jīng)元的衰老情況;⑶通過western blot方法檢測神經(jīng)元-星形膠質細胞間代謝偶聯(lián)相關單羧酸轉運體蛋白表達情況(MCT1,MCT2,MCT4);通過試劑盒檢測培養(yǎng)基中、神經(jīng)元細胞內及星型膠質細胞內相關能量代謝底物如乳酸、丙酮酸等變化;檢測糖酵解相關關鍵酶的活性及蛋白表達情況;檢測谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)中相關轉運體的蛋白表達變化及谷氨酸濃度變化;⑷通過選取可以改善胰島素抵抗的降糖藥物進行干預,通過HE染色、尼氏染色觀察神經(jīng)元的形態(tài)變化;通過流式細胞術等方法檢測降糖藥物對神經(jīng)元凋亡的改善作用;通過β半乳糖苷酶染色法以及衰老相關蛋白Sirt1蛋白表達情況評估降糖藥物對神經(jīng)元衰老的影響;通過western blot檢測神經(jīng)元-星形膠質細胞間代謝偶聯(lián)相關轉運體的蛋白表達變化;通過試劑盒檢測神經(jīng)元-星形膠質細胞間代謝偶聯(lián)相關能量底物的變化;檢測谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)中相關轉運體及谷氨酸等濃度變化。研究結果:⑴利用改良的“三明治式”共培養(yǎng)方法建立神經(jīng)元-星形膠質細胞共培養(yǎng)體系能夠在最大程度上模擬機體中樞部位微環(huán)境,更有利于神經(jīng)元生長,神經(jīng)元形態(tài)更為健康,且共培養(yǎng)體系下神經(jīng)元細胞活性更高;與葡萄糖、胰島素相比,棕櫚酸對神經(jīng)元的殺傷作用更為明顯;且0.1mM棕櫚酸可以引起神經(jīng)元發(fā)生胰島素抵抗,表現(xiàn)為胰島素信號通路相關蛋白表達下降,即PI3K表達下降,p IRS/IRS比值及pAkt/Akt比值下降;⑵中樞胰島素抵抗可以使神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生明顯改變,細胞突起數(shù)量減少、細胞間聯(lián)系減少;突觸可塑性相關蛋白表達下降,包括PSD95,Arc,synapsin1,pCREB/CREB,BDNF等蛋白表達下降;加速神經(jīng)元凋亡情況;神經(jīng)元衰老加速,包括β半乳糖苷酶染色陽性細胞增加,端粒酶活性下降,以及衰老相關蛋白Sirt1表達降低;⑶中樞胰島素抵抗可以使神經(jīng)元-星形膠質細胞間代謝偶聯(lián)相關轉運體表達下降,培養(yǎng)基中乳酸濃度下降;而神經(jīng)元與星型膠質細胞內乳酸、丙酮酸濃度升高;與此同時神經(jīng)元與星形膠質細胞內糖酵解相關酶即己糖激酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶活性升高且蛋白表達增加;谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)相關轉運體表達下降,谷氨酸濃度異常;⑷降糖藥物可以明顯改善胰島素抵抗下神經(jīng)元細胞形態(tài)、細胞凋亡、突觸可塑性相關蛋白表達以及神經(jīng)元衰老情況;降糖藥物可以改善神經(jīng)元-星形膠質細胞間代謝偶聯(lián),減輕神經(jīng)元與星型膠質細胞內糖酵解情況并改善神經(jīng)元與星形膠質細胞間谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)。研究結論:我們利用改良的“三明治式”共培養(yǎng)方法建立神經(jīng)元-星形膠質細胞共培養(yǎng)體系,在給予棕櫚酸刺激后建立了神經(jīng)元-星形膠質細胞共培養(yǎng)體系下中樞胰島素抵抗模型,可得到以下結論:⑴中樞胰島素抵抗可以影響神經(jīng)元的形態(tài)與突觸可塑性,加速神經(jīng)元凋亡與衰老的進程;⑵而神經(jīng)元-星形膠質細胞間代謝偶聯(lián)紊亂以及神經(jīng)元內糖酵解的異常激活在中樞胰島素抵抗加速神經(jīng)元損傷與衰老過程中發(fā)揮重要作用;⑶降糖藥物可明顯改善中樞胰島素抵抗引起的神經(jīng)元形態(tài)與功能的損傷,改善神經(jīng)元衰老進程,而降糖藥物對神經(jīng)元-星形膠質細胞間代謝偶聯(lián)及糖酵解的改善作用在其中起到關鍵作用。
【圖文】：

圖 2.1 糖尿病相關性認知功能障礙的危險因素及相關生物標志物[14]。Fig 2.1 Risk factors and biomarkers for diabetes-related cognitive decline[14].2.1.1.糖尿病相關性認知障礙血清學生物標志物現(xiàn)有關于血清中相關生物標志物與糖尿病相關性認知障礙的研究相對較多，提示糖尿病相關性認知障礙可能受外周或系統(tǒng)因素影響，并不完全局限于中樞部位改變。涉及到的血清中相關生物標志物大致可分為糖代謝相關指標、胰島素抵抗相關指標及炎癥因子三大類。⑴ 糖代謝相關指標在糖尿病進展過程中糖代謝紊亂是最為明顯的臨床表現(xiàn)，而血糖控制欠佳與糖尿病各種并發(fā)癥的發(fā)生直接相關。Zhou 等[15]通過對 114 名糖尿病伴輕度認知功能障礙（mild cognitive impairment，MCI）患者及 83 名正常認知功能的糖尿病患者進行血清檢測，，發(fā)現(xiàn)患者智力狀態(tài)檢查量表分數(shù)（mini-mental stateexamination, MMSE）與餐后 2 小時血糖(P<0.001)、空腹 C 肽水平(P=0.001)呈負

圖 2.2 胰島素信號通路傳導過程[76]。Fig 2.2 The insulin signaling pathway[76].素抵抗（IR）[77]是指機體器官組織對胰島素的生物學反應下降島素敏感性下降（受體數(shù)目減少）或胰島素反應性降低（受體結合胰島素受體后途徑異常，臨床表現(xiàn)為高胰島素血癥。由于與 2 型糖管疾病的發(fā)生密切相關[78]，胰島素抵抗來已成為近年的國際研究
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R587.2

【參考文獻】

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1 王承娜;林麗;段振芳;鐘飛;左代英;吳英良;;新生SD大鼠大腦皮層神經(jīng)元與星形膠質細胞的混合培養(yǎng)[J];藥學學報;2013年11期

本文編號：2691770