【摘要】：氟元素(F)具有極強(qiáng)的氧化能力,是典型的負(fù)電性元素,是最活潑的非金屬元素,可以直接或間接地與幾乎所有元素化合生成相應(yīng)的氟化物,主要以無(wú)機(jī)氟化物的形式存在于自然界中。氟幾乎存在于人類(lèi)生活環(huán)境的各個(gè)方面,但機(jī)體攝入氟的主要途徑是飲水、食物和空氣。機(jī)體長(zhǎng)期攝入過(guò)量氟,致使氟在體內(nèi)蓄積過(guò)多,引起機(jī)體損傷,稱(chēng)為地方性氟中毒,簡(jiǎn)稱(chēng)地氟病。氟中毒對(duì)機(jī)體骨相器官和非骨相器官都具有明顯的損害,但具體機(jī)制尚未明了。近年來(lái),有關(guān)氟中毒的“鈣矛盾疾病”的研究逐漸成為熱點(diǎn)。鈣離子通道作為跨越細(xì)胞膜的一組蛋白質(zhì)大分子,嚴(yán)格控制著鈣離子進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程,鈣離子通道活性的變化可能是神經(jīng)細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)機(jī)制之一,因此研究氟作用條件下神經(jīng)細(xì)胞的鈣穩(wěn)態(tài)變化在氟中毒的發(fā)病機(jī)制研究中非常必要。L型鈣離子通道是控制鈣離子內(nèi)流的主要通道,參與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子水平,參與神經(jīng)細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)、突觸可塑性、學(xué)習(xí)記憶等功能調(diào)節(jié)。PC12細(xì)胞來(lái)自大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤,經(jīng)神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)誘導(dǎo),可增殖、分化為有交感神經(jīng)元特性的細(xì)胞,被廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的體外研究項(xiàng)目中。本實(shí)驗(yàn)采用PC12細(xì)胞高氟(5.0mM)/低氟(0.5mM)暴露,首次采用高氟/低氟聯(lián)合L型鈣離子通道激動(dòng)劑FPL64176(0.5umol/L)/拮抗劑Nifedipine(0.2umol/L)(對(duì)照組、高氟組、低氟組、高氟+激動(dòng)劑組、高氟+拮抗劑組、低氟+激動(dòng)劑組、低氟+拮抗劑組)暴露后,在不同的作用時(shí)間段(2、4、6、8、10、12和24h)用cck-8檢測(cè)PC12細(xì)胞活力;氟暴露2h后,用DCF熒光染色標(biāo)記檢測(cè)PC12細(xì)胞內(nèi)活性氧;用Hoechst-33342檢測(cè)PC12細(xì)胞凋亡的情況:氟暴露24h后,用倒置光學(xué)顯微鏡直接觀察PC12細(xì)胞形態(tài)改變,應(yīng)用RT-PCR/westem blot方法檢測(cè)PC12細(xì)胞L型鈣離子通道Cav1.2及下游相關(guān)基因/蛋白CAMKⅡ、c-fos、Bax、bcl-2的表達(dá)情況。探討L-型鈣通道在氟致PC12細(xì)胞損傷中的作用及分子機(jī)理,這對(duì)于進(jìn)一步探究地氟病的發(fā)病機(jī)制及防治方法具有重要的科學(xué)價(jià)值和臨床意義。染氟2/4/6/8/10/24h后,HF組細(xì)胞存活率較對(duì)照組顯著(P0.05)或極顯著下降(P0.01);染氟2/4/6/8/10h后,HF+N組細(xì)胞存活率較顯著上升(P0.05)。PC12細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,染氟24h后,HF組細(xì)胞密度減小,部分細(xì)胞開(kāi)始收縮變圓,凋亡細(xì)胞數(shù)目增多,有的甚至可以看到細(xì)胞碎片;HF+N組凋亡細(xì)胞數(shù)目較HF組明顯變少。染氟組細(xì)胞內(nèi)鈣離子/細(xì)胞內(nèi)活性氧/細(xì)胞凋亡水平顯著(P0.05)或極顯著(P0.01)上升,HF+P/LF+P組細(xì)胞內(nèi)鈣離子/細(xì)胞內(nèi)活性氧顯著上升(P0.05)或極顯著上升(P0.01),HF+N/LF+N組細(xì)胞內(nèi)鈣離子/細(xì)胞內(nèi)活性氧水平顯著下降(P0.05)或極顯著下降(P0.01)。L-型鈣離子通道及下游相關(guān)基因/蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示,HF組Cav1.2基因/蛋白、CAMKⅡ基因表達(dá)水平較對(duì)照組極顯著下降(P0.01),c-fos基因、Bax/bcl-2基因/蛋白比值表達(dá)水平極顯著上升(P0.01),HF+P組Cav1.2基因表達(dá)水平較HF組呈現(xiàn)極顯著下降(P0.01),HF+N/LF+N 組 Cavl.2、CAMKⅡ、bcl-2、Bax 蛋白的表達(dá)水平極顯著上升(P0.01),c-fos、Bax/bcl-2比值蛋白表達(dá)水平極顯著下降(P0.01)。綜上所述,氟暴露可降低細(xì)胞存活率,在一定暴露時(shí)間段內(nèi),使細(xì)胞內(nèi)活性氧水平、細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平、細(xì)胞凋亡水平上升,呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性,提示氟暴露可致細(xì)胞氧化應(yīng)激增強(qiáng);而L型鈣離子通道激動(dòng)劑FPL64176可在一定程度上加劇氟中毒,L型鈣離子通道拮抗劑Nifedipine則可在一定程度上改善氟中毒致細(xì)胞損傷,Cav1.2蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)規(guī)律性變化,提示Cav1.2分子可能是氟中毒治療中的重要分子靶點(diǎn),L型鈣離子通道抑制劑Nifedipine可能是氟中毒的有效治療藥物之一。
【圖文】：

３實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑３．邋１細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果逡逑細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果如圖３．１。逡逑１邋ＩＣ￣逡逑２邐ｗｍｎ？逡逑１邐＿ｌｆ逡逑＾＾ＨＦ＋Ｐ逡逑＾＾ＨＦ＋Ｎ逡逑＇邐＾＾ＬＦ＋Ｐ逡逑ＦｈＴＨＩＬＦ－ｈＮ逡逑１１１１逡逑２ｈ邐４ｈ邐６ｈ邐８ｈ邋１０ｈ邐１２ｈ邐２４ｈ逡逑圖３．邋１邋ｃｃｋ－８檢測(cè)細(xì)胞存活率逡逑注：＞＜０．０５，邋￣Ｐ＜０．０１，與對(duì)照組（Ｃ）相比；逡逑＊Ｐ＜０．邋０５，邋＂Ｐ＜０．邋０１，ＨＦ＋Ｐ，ＨＦ＋Ｎ組與ＨＦ組相比；逡逑‘Ｐ＜０．邋０５，邋＊‘Ｐ＜０．邋０１，邋ＬＦ＋Ｐ，邋ＬＦ＋Ｎ組與ＬＦ組相比；逡逑與對(duì)照組相比，染氟２ｈ后，ＨＦ組細(xì)胞存活率極顯著下降（Ｐ＜０．０１）；與ＨＦ逡逑組相比，染氟２ｈ后，ＨＦ＋Ｎ組細(xì)胞存活率顯著上升（Ｐ＜０．０５）；與對(duì)照組相比，染氟逡逑４ｈ后，ＨＦ和ＬＦ組細(xì)胞存活率極顯著下降（Ｐ＜０．０１）；與ＨＦ氟組相比，染氟４ｈ逡逑后，ＨＦ＋Ｎ組細(xì)胞存活率顯著上升（Ｐ＜０．０５）；與ＬＦ組相比，染氟４ｈ后，ＬＦ＋Ｎ逡逑組細(xì)胞存活率顯著上升（Ｐ＜0．0５）；與ＨＦ組相比

ＨＦ組細(xì)胞存活率極顯著下降（Ｐ＜０．０１）。逡逑３．邋２細(xì)胞形態(tài)觀察逡逑細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果如圖３．２。逡逑Ｂ邋Ｃ邋Ｄ逡逑Ｅ邐：：邐．—邋Ｇ邐；＾ｍ逡逑圖３．２邋細(xì)胞形態(tài)觀察逡逑Ａ：對(duì)照組（Ｃｏｎｔｒｏｌ）邐Ｂ：ＨＦ邋組邋Ｇ：ＬＦ邋組逡逑Ｄ：ＨＦ＋Ｐ邋組（ＨＦ＋ＦＰＬ６４１７６）邋Ｅ：ＨＦ＋Ｎ邋組（ＨＦ＋Ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ）逡逑Ｆ：ＬＦ＋Ｐ邋組（ＬＦ＋ＦＰＬ６４１７６）邋Ｇ：ＬＦ＋Ｎ邋組（ＬＦ＋Ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ）逡逑由圖２可見(jiàn)，對(duì)照組ＰＣ１２細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，有２到多個(gè)突起，染氟２４ｈ后，逡逑ＨＦ組細(xì)胞的密度下降，有部分細(xì)胞開(kāi)始變圓，凋亡細(xì)胞的數(shù)目變多，甚至有的逡逑可以看到明顯的細(xì)胞碎片（圖２Ｂ）和凋亡小泡；與ＨＦ組相比，，ＨＦ＋Ｎ組碉亡逡逑細(xì)胞數(shù)目明顯變少。逡逑２３逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R599.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2691766