發(fā)布時間：2020-06-01 16:40

【摘要】：氟元素(F)具有極強的氧化能力,是典型的負電性元素,是最活潑的非金屬元素,可以直接或間接地與幾乎所有元素化合生成相應(yīng)的氟化物,主要以無機氟化物的形式存在于自然界中。氟幾乎存在于人類生活環(huán)境的各個方面,但機體攝入氟的主要途徑是飲水、食物和空氣。機體長期攝入過量氟,致使氟在體內(nèi)蓄積過多,引起機體損傷,稱為地方性氟中毒,簡稱地氟病。氟中毒對機體骨相器官和非骨相器官都具有明顯的損害,但具體機制尚未明了。近年來,有關(guān)氟中毒的“鈣矛盾疾病”的研究逐漸成為熱點。鈣離子通道作為跨越細胞膜的一組蛋白質(zhì)大分子,嚴(yán)格控制著鈣離子進入細胞的過程,鈣離子通道活性的變化可能是神經(jīng)細胞凋亡的啟動機制之一,因此研究氟作用條件下神經(jīng)細胞的鈣穩(wěn)態(tài)變化在氟中毒的發(fā)病機制研究中非常必要。L型鈣離子通道是控制鈣離子內(nèi)流的主要通道,參與細胞質(zhì)內(nèi)鈣離子水平,參與神經(jīng)細胞鈣穩(wěn)態(tài)、突觸可塑性、學(xué)習(xí)記憶等功能調(diào)節(jié)。PC12細胞來自大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞瘤,經(jīng)神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)誘導(dǎo),可增殖、分化為有交感神經(jīng)元特性的細胞,被廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的體外研究項目中。本實驗采用PC12細胞高氟(5.0mM)/低氟(0.5mM)暴露,首次采用高氟/低氟聯(lián)合L型鈣離子通道激動劑FPL64176(0.5umol/L)/拮抗劑Nifedipine(0.2umol/L)(對照組、高氟組、低氟組、高氟+激動劑組、高氟+拮抗劑組、低氟+激動劑組、低氟+拮抗劑組)暴露后,在不同的作用時間段(2、4、6、8、10、12和24h)用cck-8檢測PC12細胞活力;氟暴露2h后,用DCF熒光染色標(biāo)記檢測PC12細胞內(nèi)活性氧;用Hoechst-33342檢測PC12細胞凋亡的情況:氟暴露24h后,用倒置光學(xué)顯微鏡直接觀察PC12細胞形態(tài)改變,應(yīng)用RT-PCR/westem blot方法檢測PC12細胞L型鈣離子通道Cav1.2及下游相關(guān)基因/蛋白CAMKⅡ、c-fos、Bax、bcl-2的表達情況。探討L-型鈣通道在氟致PC12細胞損傷中的作用及分子機理,這對于進一步探究地氟病的發(fā)病機制及防治方法具有重要的科學(xué)價值和臨床意義。染氟2/4/6/8/10/24h后,HF組細胞存活率較對照組顯著(P0.05)或極顯著下降(P0.01);染氟2/4/6/8/10h后,HF+N組細胞存活率較顯著上升(P0.05)。PC12細胞呈長梭形,染氟24h后,HF組細胞密度減小,部分細胞開始收縮變圓,凋亡細胞數(shù)目增多,有的甚至可以看到細胞碎片;HF+N組凋亡細胞數(shù)目較HF組明顯變少。染氟組細胞內(nèi)鈣離子/細胞內(nèi)活性氧/細胞凋亡水平顯著(P0.05)或極顯著(P0.01)上升,HF+P/LF+P組細胞內(nèi)鈣離子/細胞內(nèi)活性氧顯著上升(P0.05)或極顯著上升(P0.01),HF+N/LF+N組細胞內(nèi)鈣離子/細胞內(nèi)活性氧水平顯著下降(P0.05)或極顯著下降(P0.01)。L-型鈣離子通道及下游相關(guān)基因/蛋白表達檢測結(jié)果顯示,HF組Cav1.2基因/蛋白、CAMKⅡ基因表達水平較對照組極顯著下降(P0.01),c-fos基因、Bax/bcl-2基因/蛋白比值表達水平極顯著上升(P0.01),HF+P組Cav1.2基因表達水平較HF組呈現(xiàn)極顯著下降(P0.01),HF+N/LF+N 組 Cavl.2、CAMKⅡ、bcl-2、Bax 蛋白的表達水平極顯著上升(P0.01),c-fos、Bax/bcl-2比值蛋白表達水平極顯著下降(P0.01)。綜上所述,氟暴露可降低細胞存活率,在一定暴露時間段內(nèi),使細胞內(nèi)活性氧水平、細胞內(nèi)鈣離子水平、細胞凋亡水平上升,呈現(xiàn)一定的劑量依賴性,提示氟暴露可致細胞氧化應(yīng)激增強;而L型鈣離子通道激動劑FPL64176可在一定程度上加劇氟中毒,L型鈣離子通道拮抗劑Nifedipine則可在一定程度上改善氟中毒致細胞損傷,Cav1.2蛋白表達水平呈現(xiàn)規(guī)律性變化,提示Cav1.2分子可能是氟中毒治療中的重要分子靶點,L型鈣離子通道抑制劑Nifedipine可能是氟中毒的有效治療藥物之一。
【圖文】：

３實驗結(jié)果逡逑３．邋１細胞活力檢測結(jié)果逡逑細胞活力檢測結(jié)果如圖３．１。逡逑１邋ＩＣ￣逡逑２邐ｗｍｎ？逡逑１邐＿ｌｆ逡逑＾＾ＨＦ＋Ｐ逡逑＾＾ＨＦ＋Ｎ逡逑＇邐＾＾ＬＦ＋Ｐ逡逑ＦｈＴＨＩＬＦ－ｈＮ逡逑１１１１逡逑２ｈ邐４ｈ邐６ｈ邐８ｈ邋１０ｈ邐１２ｈ邐２４ｈ逡逑圖３．邋１邋ｃｃｋ－８檢測細胞存活率逡逑注：＞＜０．０５，邋￣Ｐ＜０．０１，與對照組（Ｃ）相比；逡逑＊Ｐ＜０．邋０５，邋＂Ｐ＜０．邋０１，ＨＦ＋Ｐ，ＨＦ＋Ｎ組與ＨＦ組相比；逡逑‘Ｐ＜０．邋０５，邋＊‘Ｐ＜０．邋０１，邋ＬＦ＋Ｐ，邋ＬＦ＋Ｎ組與ＬＦ組相比；逡逑與對照組相比，染氟２ｈ后，ＨＦ組細胞存活率極顯著下降（Ｐ＜０．０１）；與ＨＦ逡逑組相比，染氟２ｈ后，ＨＦ＋Ｎ組細胞存活率顯著上升（Ｐ＜０．０５）；與對照組相比，染氟逡逑４ｈ后，ＨＦ和ＬＦ組細胞存活率極顯著下降（Ｐ＜０．０１）；與ＨＦ氟組相比，染氟４ｈ逡逑后，ＨＦ＋Ｎ組細胞存活率顯著上升（Ｐ＜０．０５）；與ＬＦ組相比，染氟４ｈ后，ＬＦ＋Ｎ逡逑組細胞存活率顯著上升（Ｐ＜0．0５）；與ＨＦ組相比

ＨＦ組細胞存活率極顯著下降（Ｐ＜０．０１）。逡逑３．邋２細胞形態(tài)觀察逡逑細胞形態(tài)觀察結(jié)果如圖３．２。逡逑Ｂ邋Ｃ邋Ｄ逡逑Ｅ邐：：邐．—邋Ｇ邐；＾ｍ逡逑圖３．２邋細胞形態(tài)觀察逡逑Ａ：對照組（Ｃｏｎｔｒｏｌ）邐Ｂ：ＨＦ邋組邋Ｇ：ＬＦ邋組逡逑Ｄ：ＨＦ＋Ｐ邋組（ＨＦ＋ＦＰＬ６４１７６）邋Ｅ：ＨＦ＋Ｎ邋組（ＨＦ＋Ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ）逡逑Ｆ：ＬＦ＋Ｐ邋組（ＬＦ＋ＦＰＬ６４１７６）邋Ｇ：ＬＦ＋Ｎ邋組（ＬＦ＋Ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ）逡逑由圖２可見，對照組ＰＣ１２細胞呈長梭形，有２到多個突起，染氟２４ｈ后，逡逑ＨＦ組細胞的密度下降，有部分細胞開始變圓，凋亡細胞的數(shù)目變多，甚至有的逡逑可以看到明顯的細胞碎片（圖２Ｂ）和凋亡小泡；與ＨＦ組相比，，ＨＦ＋Ｎ組碉亡逡逑細胞數(shù)目明顯變少。逡逑２３逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R599.1

【參考文獻】

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本文編號：2691766