【摘要】：尋找生理pH條件下活性及熱穩(wěn)定性足夠高尿酸酶是藥用及診斷用尿酸酶研究的難點(diǎn)�？燎笱挎邨U菌ATCC29604尿酸酶(Bacillus fastidious uricase,BFU)含322個(gè)氨基酸殘基,其活性形式為四聚體。通過(guò)表征BFU及其不同突變體的熱穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)BFU生理?xiàng)l件下無(wú)平臺(tái)期,低濃度體系的半衰期約為26天,而雙突變體AER/V144A/Y319R的熱穩(wěn)定性在不同條件下均明顯增強(qiáng),生理?xiàng)l件下平臺(tái)期最長(zhǎng)可達(dá)42天,半衰期可達(dá)147天,是目前生理?xiàng)l件下穩(wěn)定性最好的尿酸酶。但該雙突變體活性最高的最適pH是堿性,亟待優(yōu)化該突變體的最適pH到中性。購(gòu)于中國(guó)微生物菌種保藏中心的酵母細(xì)胞株C.G.M.C.C 2.1008經(jīng)菌種鑒定為季也蒙畢赤酵母菌,但無(wú)法確定其具體菌種。該酵母株經(jīng)尿酸誘導(dǎo)表達(dá)的季也蒙畢赤酵母尿酸酶(Meyerozyma guilliermondii uricase,MGU)在硼酸硼砂緩沖液中的最適pH為中性。通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜分析各胰蛋白酶解肽段發(fā)現(xiàn)MGU與尿酸酶A5DFP1高度相似;轉(zhuǎn)錄組測(cè)序交叉驗(yàn)證結(jié)果支持該尿酸酶基因的高效誘導(dǎo)表達(dá)。根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中A5DFP1的編碼序列設(shè)計(jì)引物,從C.G.M.C.C 2.1008細(xì)胞株cDNA中PCR擴(kuò)增尿酸酶基因后,構(gòu)建帶6His標(biāo)簽的重組表達(dá)質(zhì)粒pDE1-MGU、pDE2-MGU以及無(wú)6His標(biāo)簽的表達(dá)質(zhì)粒R-MGU。在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)此真菌尿酸酶,SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)重組R-MGU肽段約35kDa;MALDI-TOF-MS發(fā)現(xiàn)R-MGU肽段約17.43kDa且與天然尿酸酶MGU一致,但按氨基酸序列計(jì)算的分子量為33.98 kDa,表明其可能存在化學(xué)修飾。測(cè)定其動(dòng)力學(xué)參數(shù)及抑制劑敏感性等性質(zhì),并與天然尿酸酶進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)帶6His標(biāo)簽?zāi)蛩崦讣兓蟊然钚越咏?.0U/mg;R-MGU米氏常數(shù)、競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的抑制常數(shù)及分子量與天然尿酸酶無(wú)差別,但R-MGU很難純化,使其相同條件下的熱穩(wěn)定性比純化天然酶略差。綜上所述,BFU雙突變體AER/V144A/Y319R優(yōu)良的熱穩(wěn)定性使其作為起始酶已非常有吸引力,但其最適p H為堿性,生理?xiàng)l件下活性不高是其最大遺憾,優(yōu)化該突變體的最適pH到中性有重要意義;MGU具有最適pH為中性的特點(diǎn),對(duì)其進(jìn)行成功克隆和表達(dá)并表征將有利于進(jìn)一步解析該尿酸酶最適p H的決定因素,以此為基礎(chǔ)對(duì)BFU雙突變體AER/V144A/Y319R進(jìn)行合理改造,在BFU突變體上生成與MGU類(lèi)似的相互作用網(wǎng)絡(luò),將是優(yōu)化其最適pH到接近中性的有效策略。
【圖文】：

圖 1 苛求芽孢桿菌尿酸酶不同突變體熱失活曲線Fig.1 Thermoinactivation processes of Bacillus fastidiosus mutants(a): Low concentration of AER (b): High concentration of AER(c): Low concentration of AER/V144A/Y319R (d): High concentration of AER/V144A/Y319R

2 突變體 AER/V144A/Y319R 熱失活過(guò)程電泳 thermoinactivation processes of the mutant AER/V1 7.4 + 30μM 氧嗪酸鉀 3: pH 9.2 4: pH 9.2 + 30μ(a):Activity at 100% (b): Activity at 20%桿菌尿酸酶進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)其活性形式為四對(duì)熱穩(wěn)定性明顯增強(qiáng)的突變體 AER/V144A100%和活力衰減至20%左右時(shí)分別取相同量熱失活過(guò)程中的四聚體和二聚體變化。電泳體系中的四聚體減少，二聚體有所增加。氧嗪酸鉀抑制常數(shù)(Ki)尿酸酶野生型(BFU)相比，不同突變體在不導(dǎo)致其 Ki的改變。通過(guò)不同抑制劑濃度下記
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R589.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2689115