【摘要】：背景和目的自噬及氧化應(yīng)激在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。晚期氧化蛋白產(chǎn)物(Advanced Oxidative Protein Products,AOPPs)是氧化應(yīng)激標(biāo)志物和炎癥介質(zhì),觸發(fā)NADPH氧化酶(NOX)依賴性的活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生。自噬作為適應(yīng)性反應(yīng)機(jī)制保護(hù)軟骨細(xì)胞免受各種環(huán)境變化應(yīng)激。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴性組蛋白去乙�；�,其在調(diào)節(jié)細(xì)胞生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,包括細(xì)胞衰老,細(xì)胞生長和細(xì)胞存活等,同時(shí)也是激活自噬經(jīng)典的信號(hào)通路。羥基酪醇(hydroxytyrosol,HT)具有抗炎,抗氧化和自噬增強(qiáng)的作用。研究表明HT可通過激活自噬SIRT1通路緩解過氧化氫(H202)處理的細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)。然而,在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的病理生理學(xué)中,羥基酪醇是否調(diào)節(jié)Sirtl信號(hào)抵抗AOPPs損傷作用仍然是未知的。因此,本研究旨在研究HT是否緩解AOPPs氧化應(yīng)激損傷作用以及可能的潛在機(jī)制。方法1.HT緩解軟骨細(xì)胞AOPPs氧化應(yīng)激損傷用CCK-8kit探索AOPPs對(duì)細(xì)胞增殖活性的濃度梯度的影響。使用200ug/ml AOPPs處理軟骨細(xì)胞2h,DCFH-DA熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)量。采用HT 75umol/ml預(yù)處理軟骨細(xì)胞30min,重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。2.HT調(diào)節(jié)自噬緩解軟骨細(xì)胞AOPPs炎性損傷用westernblot檢測細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白,觀察自噬相關(guān)的時(shí)間梯度;設(shè)置200ug/ml AOPPs單獨(dú)組以及200ug/ml AOPPs和不同濃度的HT(10,50和100umol/ml)共處理組,分別處理軟骨細(xì)胞2h。使用自噬抑制劑氯喹做陰性對(duì)照組。3.HT通過SIRT信號(hào)通路調(diào)節(jié)自噬緩解軟骨細(xì)胞AOPPs損傷HT預(yù)處理細(xì)胞后加入AOPPs,western blot檢測SIRT1蛋白表達(dá)情況。使用siRNA特異性干擾SIRT1表達(dá)后,繼續(xù)觀察自噬表達(dá)情況以及相關(guān)的生物學(xué)活性和特性的檢測。結(jié)果1.HT緩解軟骨細(xì)胞AOPPs氧化應(yīng)激損傷CCK-8結(jié)果顯示,AOPPs濃度越大細(xì)胞增殖活性越低。AOPPs處理后細(xì)胞ROS水平、炎性因子(IL-6,TNFα)、MMP-13、NADPH氧化酶(NOX2和NOX4)明顯升高。相反,使用HT預(yù)處理明顯改善了AOPPs對(duì)軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激損害。由此可見,HT可緩解AOPPs對(duì)軟骨細(xì)胞細(xì)胞毒性。2.HT調(diào)節(jié)自噬緩解軟骨細(xì)胞AOPPs炎性損傷HT預(yù)處理細(xì)胞后與AOPPs共培養(yǎng),細(xì)胞自噬水平增高。加入自噬劑氯喹,HT所介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞保護(hù)作用明顯消失,進(jìn)一步論證調(diào)節(jié)自噬是HT保護(hù)軟骨細(xì)胞免受AOPPs損傷的重要機(jī)制。3.HT通過SIRT1信號(hào)通路調(diào)節(jié)自噬緩解軟骨細(xì)胞AOPPs損傷與AOPPs單獨(dú)處理組相比,HT顯著提高了SIRT1蛋白表達(dá)。使用siRNA特異性干擾Sirt-1的表達(dá)后,由HT介導(dǎo)的自噬增強(qiáng)作用消失,與此同時(shí)AOPPs依賴性的NADPH氧化酶(NOX2和NOX4)表達(dá)升高。結(jié)論HT通過SIRT1通路增強(qiáng)細(xì)胞自噬緩解AOPPs引起氧化應(yīng)激及炎性損傷。
【圖文】：

圖１－２軟骨細(xì)胞使用或不使用ＨＴ預(yù)處理半小時(shí)，后用２００ｍｇ／ｍｌ的ＡＯＰＰｓ處理不同時(shí)間（０、逡逑６、１２、２４、４８ｈ）。數(shù)據(jù)表示為平均值土ＳＥＭ，邋ｎ邋＝邋３。與對(duì)照組相比，＊Ｐ＜０．０５和＊＊Ｐ＜０．０１。逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ－２邋Ｔｈｅ邋ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ邋ｗｅｒｅ邋ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｏｒ邋ｗｉｔｈｏｕｔ邋ＨＴ邋７５｜ｉＭ邋ｆｏｒ邋３０ｍｉｎ邋ａｎｄ邋ｔｈｅｎ逡逑ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＡＯＰＰｓ邋２００ｕｇ／ｍｌ邋ｆｏｒ邋ｔｈｅ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｉｍｅ．邋＊Ｐ邋＜邋０．０５邋ａｎｄ邋＊＊Ｐ邋＜邋０．０１邋ｖｓ．邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑ｇｒｏｕｐ．邋＆邋Ｐ邋＜邋０．０５邋ＡＯＰＰｓ邋ｇｒｏｕｐ邋ｖｓ．ＨＴ＋ＡＯＰＰｓ邋ｇｒｏｕｐ邋ａｔ邋６ｈｏｕｒ．逡逑３．邋ＨＴ緩解ＡＯＰＰｓ誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)活性氧（ＲＯＳ）生成逡逑之前研究表明，ＡＯＰＰｓ作為晚期氧化蛋白產(chǎn)物，顯著升高細(xì)胞內(nèi)ＲＯＳ水平逡逑從而造成細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。為了進(jìn)一步明確ＨＴ的保護(hù)作用，，通過ＨＴ預(yù)處理逡逑暴露于ＡＯＰＰｓ軟骨細(xì)胞，與單獨(dú)ＡＯＰＰｓ處理組相比，細(xì)胞內(nèi)ＲＯＳ水平明顯降逡逑低。以上證明了邋ＨＴ可以降低細(xì)胞ＲＯＳ生成從而緩解ＡＯＰＰｓ所致的氧化應(yīng)激損逡逑１２逡逑

邋＾邋＾逡逑Ｔｉｍｅ逡逑圖１－２軟骨細(xì)胞使用或不使用ＨＴ預(yù)處理半小時(shí)，后用２００ｍｇ／ｍｌ的ＡＯＰＰｓ處理不同時(shí)間（０、逡逑６、１２、２４、４８ｈ）。數(shù)據(jù)表示為平均值土ＳＥＭ，邋ｎ邋＝邋３。與對(duì)照組相比，＊Ｐ＜０．０５和＊＊Ｐ＜０．０１。逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ－２邋Ｔｈｅ邋ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ邋ｗｅｒｅ邋ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｏｒ邋ｗｉｔｈｏｕｔ邋ＨＴ邋７５｜ｉＭ邋ｆｏｒ邋３０ｍｉｎ邋ａｎｄ邋ｔｈｅｎ逡逑ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＡＯＰＰｓ邋２００ｕｇ／ｍｌ邋ｆｏｒ邋ｔｈｅ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｉｍｅ．邋＊Ｐ邋＜邋０．０５邋ａｎｄ邋＊＊Ｐ邋＜邋０．０１邋ｖｓ．邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑ｇｒｏｕｐ．邋＆邋Ｐ邋＜邋０．０５邋ＡＯＰＰｓ邋ｇｒｏｕｐ邋ｖｓ．ＨＴ＋ＡＯＰＰｓ邋ｇｒｏｕｐ邋ａｔ邋６ｈｏｕｒ．逡逑３．邋ＨＴ緩解ＡＯＰＰｓ誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)活性氧（ＲＯＳ）生成逡逑之前研究表明，ＡＯＰＰｓ作為晚期氧化蛋白產(chǎn)物，顯著升高細(xì)胞內(nèi)ＲＯＳ水平逡逑從而造成細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。為了進(jìn)一步明確ＨＴ的保護(hù)作用，通過ＨＴ預(yù)處理逡逑暴露于ＡＯＰＰｓ軟骨細(xì)胞，與單獨(dú)ＡＯＰＰｓ處理組相比，細(xì)胞內(nèi)ＲＯＳ水平明顯降逡逑低。以上證明了邋ＨＴ可以降低細(xì)胞ＲＯＳ生成從而緩解ＡＯＰＰｓ所致的氧化應(yīng)激損逡逑１２逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R593.22

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本文編號(hào)：2689041