【摘要】：研究背景:支氣管哮喘(哮喘)是兒童最常見的慢性呼吸道疾病,反復發(fā)作會嚴重影響兒童的健康和生活質量。近30年來我國城市兒童哮喘患病率呈顯著上升趨勢。哮喘是一種以氣道高反應性、炎癥細胞浸潤、黏液過度產生和氣道重塑為特征的慢性炎癥性疾病,可由呼吸道感染、變應原暴露、劇烈運動、氣候變化等誘發(fā),吸入糖皮質激素是治療哮喘的經典藥物,部分患兒治療效果不好。約有5%～10%的哮喘患者即使接受高劑量的吸入糖皮質激素治療甚至加用全身使用的糖皮質激素,哮喘仍然反復發(fā)作,嚴重時會危及生命,不僅影響生活質量,對醫(yī)療支出也有重大影響。因此,闡明哮喘的免疫調控機制具有重要意義,可為研發(fā)治療哮喘的新方法提供新的候選靶分子。哮喘發(fā)病機制非常復雜,對哮喘發(fā)病機制的研究在過去幾年中取得了較多進展,當前認為Thl/Th2平衡失調所致Th2優(yōu)勢是哮喘發(fā)病機制之一。Th2細胞因子白細胞介素(interleukin,IL)4、IL-13在哮喘發(fā)病中起重要作用。近幾年研究發(fā)現,巨噬細胞極化與哮喘關系密切。巨噬細胞極化是指巨噬細胞在體內微環(huán)境刺激下轉化成一種特定的表型并出現特定功能的過程。巨噬細胞有兩種主要表型,即經典激活或M1型巨噬細胞和選擇性激活或M2型巨噬細胞。M1型巨噬細胞有促炎作用,由脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)單獨或與Th1細胞因子如干擾素γ(Interferon γ,IFN-γ)聯(lián)合誘導極化,產生促炎細胞因子如白介素-1β(Interleukin 1β,IL-1β),IL-6,IL-12,IL-23和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α);M2型巨噬細胞有抗炎和免疫調節(jié)作用,有四個亞群M2a,M2b,M2c和M2d。巨噬細胞M2a亞群由IL-4和IL-13誘導,產生抗炎細胞因子IL-10及轉化生長因子β(transforming growth factor β,TGF-β)。M1/M2極化狀態(tài)可通過復雜和相互作用的內源性細胞信號通路及其調節(jié)因子被快速誘導并完全逆轉或復極化。IL-4可通過JAK/STAT與PI3K/Akt信號通路誘導巨噬細胞M2極化,參與哮喘的調控,因此,闡明IL-4誘導的巨噬細胞M2極化的免疫調控機制,可為治療哮喘的新方法提供新的思路。腫瘤壞死因子α誘導蛋白8樣分子2(tumor necrosis factor-α-induced protein 8-like 2,TIPE2)是腫瘤壞死因子α誘導蛋白8(tumor necrosis factor-α-induced protein 8,TNFAIP8)家族成員之一,最早在小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎動物模型中發(fā)現的,TIPE2主要表達于胸腺、淋巴結、脾臟及小腸粘膜等,在巨噬細胞、T淋巴細胞和B淋巴細胞等免疫細胞中高表達,在免疫反應中發(fā)揮重要的負向調節(jié)作用。TIPE2參與多條信號通路的調控,如JNK、NF-kB等。研究發(fā)現TIPE2在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、慢性乙肝病毒感染及哮喘中表達均有改變。TIPE2在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中表達下調,有研究發(fā)現TIPE2可以通過誘導M2型巨噬細胞極化減輕系統(tǒng)性紅斑狼瘡。哮喘兒童外周血單核細胞TIPE2下調,而TIPE2是否參與哮喘的調控目前并不清楚。由于巨噬細胞M2極化與哮喘關系密切,因此我們將研究TIPE2對巨噬細胞M2極化的調控效應及機制,為今后進一步研究TIPE2在哮喘中的作用提供理論依據。在本項研究中,我們通過動物實驗明確卵清蛋白誘導的哮喘小鼠肺巨噬細胞極化狀態(tài)的改變及肺組織IL-4表達的改變。通過細胞實驗研究TIPE2對巨噬細胞極化的調控效應,并探討TIPE2調控IL-4誘導的巨噬細胞M2極化的分子機制。本項研究將為今后探索TIPE2調控哮喘的效應及機制提供理論依據。第一部分卵清蛋白誘導的哮喘小鼠肺巨噬細胞極化狀態(tài)的研究目的:1.研究卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)誘導的哮喘小鼠肺巨噬細胞極化狀態(tài)的改變。2.研究OVA誘導的哮喘小鼠肺組織中細胞因子IL-4的改變。方法:1.用OVA誘導建立哮喘小鼠模型。2.用RT-qPCR法檢測哮喘小鼠與對照小鼠肺組織中的IL-4。3.用RT-qPCR法檢測哮喘小鼠與對照小鼠肺組織中M1極化標志(iNOS)、M1極化基因(CD38)及M2極化基因(Arg-1)的表達。結果:1.OVA誘導的哮喘小鼠與對照組小鼠相比,肺組織中IL-4明顯升高。2.OVA誘導的哮喘小鼠與對照組小鼠相比,M2極化基因(Arg-1)的表達明顯升高,而M1極化標志物(iNOS)、M1極化基因(CD38)的表達沒有明顯差異。結論:OVA誘導的哮喘小鼠肺組織中IL-4升高,M2極化基因表達上調。第二部分TIPE2調控巨噬細胞極化的效應目的:在本研究中,我們在體外細胞水平檢測巨噬細胞M1及M2極化時TIPE2表達的改變,并通過將TIPE2沉默或過表達研究TIPE2對巨噬細胞極化的調控效應。方法:1.以骨髓來源巨噬細胞(bone marrow-derived macrophages,BMDMs)為研究對象,用 LPS/IFN-y 和 IL-4 分別刺激 BMDMs,用 RT-qPCR 及 Western-blot 法檢測TIPE2,以明確巨噬細胞M1和M2極化時TIPE2表達的變化。2.用shRNA將BMDMs的TIPE2沉默,用LPS/IFN-γ誘導其M1極化,用ELISA檢測M1極化細胞因子(TNF-α、IL-6)、用RT-qPCR檢測M1極化相關基因,用IL-4誘導其M2極化,用ELISA檢測M2極化細胞因子IL-10、用RT-qPCR檢測M2極化相關基因,研究TIPE2沉默對巨噬細胞M1極化和M2極化的影響。3.將BMDMs的TIPE2過表達,用LPS/IFN-y誘導其M1極化,用ELISA檢測M1極化細胞因子(TNF-α、IL-6)、用RT-qPCR檢測M1極化相關基因,用IL-4誘導其M2極化,用ELISA檢測M2極化細胞因子IL-10、用RT-qPCR檢測M2極化相關基因,研究TIPE2過表達對巨噬細胞M1極化和M2極化的影響。結果:1.LPS/IFN-γ誘導BMDMs進行M1極化,TIPE2表達下調。IL-4誘導BMDMs進行M2極化,TIPE2表達上調。2.TIPE2沉默的BMDMs,在LPS/IFN-y誘導M1極化后,與對照組BMDMs相比,M1極化細胞因子(TNF-α、IL-6)及M1極化相關基因(CD38、FPR2、GPR18)表達上調;在IL-4誘導M2極化后,與對照組BMDMs相比,M2極化細胞因子 IL-10 及 M2 極化相關基因(EGR2、MGL1、MGL2、FIZZ1、YM1、MRC1、PGC1β)表達下調。3.TIPE2過表達的BMDMs,在LPS/IFN-γ誘導M1極化后,與對照組BMDMs相比,M1極化細胞因子(TNF-α、IL-6)及M1極化相關基因(CD38、FPR2、GPR18)表達下調;在IL-4誘導M2極化后,與對照組BMDMs相比,M2極化細胞因子 IL-10 及 M2 極化相關基因(EGR2、MGL1、MGL2、FIZZ1、YM1、MRC1、PGC1β)表達上調。結論:TIPE2在巨噬細胞極化中起重要作用,可以抑制LPS/IFN-γ誘導的巨噬細胞M1極化,促進IL-4誘導的巨噬細胞M2極化。第三部分TIPE2負向調控mTORC1促進巨噬細胞M2極化目的:探討TIPE2促進巨噬細胞M2極化的分子機制。方法:1.將TIPE2過表達,檢測IL-4誘導的M2極化信號通路中關鍵蛋白(STAT6、Akt、S6K1、4E-BP1及其磷酸化),探索TIPE2對M2極化信號通路的影響。2.通過沉默結節(jié)性硬化復合物(tuberous sclerosis complex 1,TSC1)將BMDMs哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)組成性激活,檢測TIPE2過表達前后M2極化細胞因子IL-10、M2極化相關基因,明確TIPE2過表達對mTORC1組成性激活的BMDMs M2極化的影響。3.通過檢測mTORC1組成性激活的BMDMs在IL-4誘導前后Akt信號通路中的關鍵蛋白(IRS2、Akt及其磷酸化),探索TIPE2調控巨噬細胞M2極化的分子機制。結果:1.用IL-4誘導TIPE2過表達的BMDMs進行M2極化,發(fā)現與野生型BMDMs相比,Akt磷酸化增強,mTORC1下游分子S6K1和4E-BP1磷酸化減弱,M2極化細胞因子IL-10及M2極化相關基因表達增強,而STAT6及其磷酸化沒有明顯差異。2.通過sh-TSC1將BMDMs mTORC1組成性激活,并將TIPE2過表達,用IL-4誘導其進行M2極化,檢測M2極化細胞因子IL-10及M2極化相關基因,發(fā)現TIPE2過表達可增強因mTORC1組成性激活而減弱了的M2極化。3.用IL-4誘導mTORC1組成性激活的BMDMs進行M2極化,發(fā)現與野生型BMDMs相比,IRS2及Akt磷酸化減弱,mTORC1的組成性激活可減弱Akt信號通路的活化。結論:TIPE2負向調控mTORC1促進IL-4誘導的巨噬細胞M2極化。
【圖文】：

３結果逡逑３．１肺組織ＨＥ染色逡逑圖３．１是兩組小鼠（對照組與哮喘組）肺組織ＨＥ染色結果。逡逑結果顯示，對照組小鼠肺組織內支氣管肺泡結構清晰，支氣管上皮完整，支逡逑氣管菅壁和血管周圍未見明顯的炎性細胞浸潤。哮喘組小鼠肺組織內支氣管壁不逡逑規(guī)則，支氣管管壁和血管周圍有炎性細胞浸潤。逡逑！邐ｖｖｘ％ｉ逡逑，U瘈r逡逑尸：／，漏：栥，逡逑％邐＾邋Ｌ邋＊邋＾＇邋ｖ＾逡逑，＼邐＾邐＇邋Ｃ］逡逑１邐＾邋＊邋ｔＴＥｆｃｚｉ邋Ａ逡逑、逆ｓ＜邋，、：？：：逡逑－ｍｍ逡逑＼邋Ｘ邋ｃ；：＂：邋ｆ

Ｍｌ極化標志ｉＮＯＳ邋ｍＲＮＡ、Ｍｌ極化基因ＣＤ３８的表達及Ｍ２極化基因Ａｒｇ－１的表逡逑達，結果顯示與對照組小鼠相比，哮喘小鼠肺組織中巨噬細胞Ｍ２極化基因Ａｒｇ－１逡逑的表達明顯升高（如圖３．３．１），，Ｍｌ極化標志ｉＮＯＳ邋ｍＲＮＡ邋（如圖３．３．２）、Ｍｌ極化逡逑基因ＣＤ３８邋（如圖３．３．３）的表達無明顯改變。以上結果提示在卵清蛋白誘導的哮喘逡逑小鼠模型中，巨噬細胞的Ｍ２極化增強。逡逑１４逡逑
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R562.25

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本文編號：2688240