【摘要】：引言骨質(zhì)疏松(Osteoporosis,OP)是最為常見的一種骨代謝疾病,其特征為骨強(qiáng)度降低,骨組織顯微結(jié)構(gòu)退化,骨脆性增加,極大的增加了骨折風(fēng)險。然而,目前對骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制尚不明確,各種藥物起效的機(jī)制也待研究。因此闡明骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制,尋找新的藥物靶點是防治骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵科學(xué)問題。近期研究表明,p38MAPK通路是參與炎癥反應(yīng)調(diào)控的重要信號通路,其信號傳導(dǎo)途徑在間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的增殖分化中起著重要作用。p38MAPK通路激活后,成骨細(xì)胞的特異性因子Cbfa1表達(dá)增加。P38MAPK途徑可控制多種轉(zhuǎn)錄因子的基因活性表達(dá),如NF-κB、MAX、SAP-1、HSF-1等。其中,有些轉(zhuǎn)錄因子p38直接底物,而有些是間接底物。其機(jī)制尚不清楚。課題組前期研究表明,綠原酸可促進(jìn)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成骨及抑制其成脂肪分化。我們還發(fā)現(xiàn)綠原酸治療骨質(zhì)疏松模型大鼠后可增加BMSCs的成骨分化能力,增加成骨細(xì)胞的數(shù)量,提高骨質(zhì)疏松模型大鼠骨密度和骨小梁數(shù)量。但目前對于綠原酸促進(jìn)BMSCs成骨分化、增加成骨細(xì)胞數(shù)量與抑制骨質(zhì)疏松的機(jī)制,尚不清楚。為了探究綠原酸的抗骨質(zhì)疏松機(jī)制,本研究分為三部分。實驗一:基因芯片譜分析尋找目標(biāo)基因及基因發(fā)生作用的可能通路;實驗二:離體實驗驗證目標(biāo)基因的作用;實驗三:在體實驗驗證目標(biāo)基因的作用。實驗一 基因芯片譜分析卵巢去勢小鼠模型中綠原酸的抗骨質(zhì)疏松作用機(jī)制背景骨質(zhì)疏松癥是一種臨床較為常見的代謝性疾病,主要表現(xiàn)為骨量的丟失,骨小梁微結(jié)構(gòu)的破壞。女性在絕經(jīng)期后,由于體內(nèi)雌性激素的缺乏,導(dǎo)致免疫系統(tǒng)激活,炎癥因子慢性持續(xù)增高,成骨與破骨平衡打破。破骨活性高于成骨,最終造成骨質(zhì)疏松的進(jìn)一步加重。目前臨床治療骨質(zhì)疏松藥物主要是激素為主,它們都有一定的副作用,因此都在尋找替代藥物。課題組一直致力于的研究。發(fā)現(xiàn)杜仲具有抗骨質(zhì)疏松作用,且綠原酸是杜仲主要成分之一,課題組前期研究表明,綠原酸可促進(jìn)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成骨及抑制其成脂肪分化。我們還發(fā)現(xiàn)綠原酸治療骨質(zhì)疏松模型小鼠后可增加BMSCs的成骨分化能力,增加成骨細(xì)胞的數(shù)量,提高骨質(zhì)疏松模型大鼠骨密度和骨小梁數(shù)量。但目前對于綠原酸促進(jìn)BMSCs成骨分化、增加成骨細(xì)胞數(shù)量與抑制骨質(zhì)疏松的機(jī)制,尚不清楚。本實驗通過基因芯片譜分析綠原酸干預(yù)后卵巢去勢小鼠模型中的差異基因并分析其抗骨代謝可能機(jī)制,為今后發(fā)展中藥治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥提供有效的臨床依據(jù)。目的:通過基因芯片譜分析CGA干預(yù)后卵巢去勢小鼠模型的基因變化及基因可能影響的信號通路。方法:(1)將30只BALB/c小鼠隨機(jī)分為三組:假手術(shù)組(Sham組)、模型組(OVX組)、綠原酸干預(yù)組(OVXT組),每組10只。Sham組與OVX組給予生理鹽水灌胃,OVXT組給予綠原酸45mg/kg.d。每天一次,連續(xù)10W。(2)10周脫頸處死小鼠,酒精浸泡消毒后完整取出小鼠雙側(cè)股骨及脛骨。(3)從脛骨中分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)并鑒定。(4)股骨固定液固定后送Micro-CT檢測骨小梁微觀結(jié)構(gòu)變化情況。(5)微陣列圖譜鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的基因表達(dá)并用q PCR驗證。(6)KEGG分析及Wb法檢測各組細(xì)胞內(nèi)的各種激酶的的表達(dá)。(7)利用SPSS20.0軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果:(1)流式細(xì)胞儀檢測線顯示:CD_(29)和CD_(44)為陽性;CD_(34)和CD_(45)為陰性。說明提取細(xì)胞為BMSCs細(xì)胞。(2)Micro-CT顯示Sham組骨小梁數(shù)量最多,OVXT其次,OVX組最少。各項骨微小結(jié)構(gòu)如:BV/TV,Tb.N,Tb.Th,BMD等指標(biāo)三組兩兩之間比較均有差異(P0.05)。(3)通過微陣列圖譜鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的基因表達(dá),有121個基因在OVX組和OVXT組間表達(dá)差異,其中36個基因表達(dá)顯著(改變倍數(shù)2和P0.05)。而RGD1564664、Pdlim3、Myh11、Ear11和Nnat是表達(dá)差異最明顯的五個基因,通過對36個基因用q PCR驗證,Acss2、Cd24、Nnat和Pkp2四個基因的表達(dá)差異最顯著。(4)KEGG和MAPK信號通路分析,Hspa1a、Fgfr2、Gadd45a、Tgfb3、Hspa1b等5個基因定位于MAPK通路。MARK通路的經(jīng)典蛋白驗證生物信息學(xué)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)與OVX組相比,OVXT組ERK和p38磷酸化增加。結(jié)論:(1).CGA可以有效地對抗卵巢去勢小鼠模骨質(zhì)疏松,改善骨骼的骨密度。(2)Nnat可能在CGA抗骨質(zhì)疏松中起作用。(3)CGA抗骨質(zhì)疏松作用可能是通過激活MAPK通路達(dá)成的。實驗二 Nnat對卵巢去勢小鼠BMSCs成骨分化的影響及其機(jī)制的研究背景:研究表明,Nnat可激活NF-κB等炎癥因子的表達(dá),同時還可以誘導(dǎo)p38、Jun、AKT激酶磷酸化,而PI3K及p38抑制劑可阻止Nnat激活NF-κB除此之外,Nnat被認(rèn)為可激活NF-κB、MAPK、FAK信號通路。由絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和p38已被發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為對正常破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的分化和活化至關(guān)重要。各種外源刺激(如toll樣受體激動劑)和內(nèi)源性刺激(如生長因子和炎癥細(xì)胞因子)有助于確定MAPKs對破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的黏附、遷移、融合和存活、以及破骨細(xì)胞骨吸收的影響25-28。我們在第一部分的研究中發(fā)現(xiàn)CGA有抗骨質(zhì)疏松作用,與OVX組相比,OVXT組中的Nnat基因明顯增高,同時ERK和p38磷酸化增加。我們推測Nnat在卵巢去勢小鼠成骨分化中方面起作用。且其可能是通過激活與ERK和P38相關(guān)的MAPK促進(jìn)成骨分化的。目的:探討Nnat在卵巢去勢小鼠BMSCs誘導(dǎo)成骨分化過程的作用及其機(jī)制方法:(1)取第四代BMSCs,用成骨細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行成骨分化培養(yǎng),分別于誘導(dǎo)成骨分化的第0、3、5、7、10、14天,用q PCR法檢測細(xì)胞內(nèi)Nnat的轉(zhuǎn)錄水平。(2)取第四代BMSCs分成普通培養(yǎng)組(NC組)、Nnat過表達(dá)(Nnat組)、空載質(zhì)粒組(KZ組)和普通成骨培養(yǎng)(NC組)、Nnat敲低(si RAN組)、轉(zhuǎn)入空載質(zhì)粒組(KZ組)。(本實驗Nnat過表達(dá)及敲低非同步進(jìn)行)。(3)利用q PCR法檢測各組細(xì)胞內(nèi)Runx2 m RNA的轉(zhuǎn)錄水平。(4)利用PNPP法分析各組細(xì)胞中ALP的活力情況。(5)茜素紅染色測細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)評價細(xì)胞成骨能力。(6)利用Wb法檢測各組細(xì)胞內(nèi)的各種激酶的的表達(dá)。(7)統(tǒng)計分析采用SPSS20.0軟件和image J軟件進(jìn)行。結(jié)果:(1)隨著BMSCs成骨分化誘導(dǎo)時間的推移,細(xì)胞內(nèi)Nnat表達(dá)逐步增強(qiáng),有統(tǒng)計學(xué)意義。(2)q PCR檢測各組的細(xì)胞的Runx-2 m RNA表達(dá)水平顯示:與普通誘導(dǎo)成骨組(NC組)相比,Nnat過表達(dá)后(Nnat組)Runx-2 m RNA表達(dá)明顯升高,用si RNA敲低Nnat后(si RNA組),Runx-2 m RNA表達(dá)明顯下降,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。空載對照組(KZ)與相應(yīng)普通培養(yǎng)組(NC組),Runx-2 m RNA表達(dá)無明顯差異;與對應(yīng)的的實驗組比較,Runx-2 m RNA表達(dá)有明顯差異,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。(3)PNPP法檢測各組BMSCs經(jīng)誘導(dǎo)成骨后細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶(ALP)活性顯示:與對照組(NC組)相比,Nnat過表達(dá)后(Nnat組),ALP活力明顯升高,用si RNA敲低Nnat后(si RNA組),ALP活力明顯下降,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。(4)茜素紅染色檢測各組BMSCs經(jīng)誘導(dǎo)成骨后細(xì)胞內(nèi)礦化結(jié)節(jié)數(shù)顯示:與對照組(NC組)相比,Nnat過表達(dá)后(Nnat組),礦化結(jié)節(jié)數(shù)量明顯增多,用si RNA敲低Nnat后(si RNA組),礦化結(jié)節(jié)數(shù)量明顯減少,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。(5)利用WB法檢測各組細(xì)胞內(nèi)的各種激酶的的表達(dá)顯示:與對照組(NC組)相比,Nnat組ERK1/2、JNK、p38、c-Fos以及c-Jun的表達(dá)明顯增高,si RNA組ERK1/2、ERK5、p38以及c-Jun的表達(dá)明顯減低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論:1.Nnat能夠調(diào)控卵巢去勢小鼠BMSCs的成骨分化。Nnat表達(dá)增高,促進(jìn)成骨分化,Nnat表達(dá)降低,抑制成骨分化。2.Nnat調(diào)控BMSCs誘導(dǎo)成骨分化是通過MAKP信號通路實現(xiàn)的。實驗三 Nnat對卵巢去勢小鼠模型骨代謝的影響研究背景動物實驗是人類直接認(rèn)識生命現(xiàn)象的重要媒介,它對于人們認(rèn)識有機(jī)界各種規(guī)律的作用是無可爭辯和無可取代的。醫(yī)學(xué)動物實驗是實現(xiàn)科學(xué)研究從分子細(xì)胞水平到臨床研究的重要紐帶。上一部分實驗發(fā)現(xiàn),Nnat能過調(diào)控OVX小鼠BMSCs誘導(dǎo)成骨分化。為了明確Nnat在在體中的作用,我們進(jìn)行動物實驗研究。目的:探討Nnat對卵巢去勢小鼠骨代謝的影響。方法:(1)將70只BALB/c小鼠按體重隨機(jī)分成7組。A組:假手術(shù)組(Sham組);B組:模型組(OVX組);C組:OVX+Nnat過表達(dá)組:D組:OVX+空載質(zhì)粒組;E組:OVX+CGA組;F組:OVX+CGA+Nnat過表達(dá)組;G組:OVX+CGA+空載質(zhì)粒組,每組各10只。各組小鼠的初始平均體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)(2)由手術(shù)當(dāng)天及術(shù)后第5周從鼠尾靜脈注入分別注入相應(yīng)的干預(yù)液體:C組和F組注入過表達(dá)Nnat病毒(10ul/次/只);D組和G組注入空載質(zhì)粒(10ul/次/只);A組、B組和E組注入生理鹽水((10ul/次/只)。(3)術(shù)后第二天開始,E、F、G組用綠原酸溶液灌胃(45 mg/kg/天),A、B、C、D用換算成同等量的0.9%氯化鈉注射液灌胃,自由飲水,攝食。每天觀察小鼠各種情況,每周測量一次體重。(4)10周脫頸處死小鼠,酒精浸泡消毒后完整取出小鼠雙側(cè)股骨及脛骨(5)從股骨中分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs),用q PCR檢查Nnat的表達(dá)。(6)脛骨micro-CT檢測骨小梁微觀結(jié)構(gòu)變化。(7)利用SPSS20.0軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果:(1)micro-CT掃描顯示:與Sham組比較,所有組卵巢去勢小鼠脛骨干骺端骨小梁數(shù)量顯著減少,OVX組和OVC+KZ組減少最多;與OVX組相比:OVX+Nnat組、OVX+CGA組、OVX+CGA+Nnat組及OVX+CGA+KZ組的骨小梁數(shù)有所增加,其中OVX+CGA+Nnat組增加更明顯,但與Sham組仍有差異。OVX組與OVX+KZ組骨小梁數(shù)差別不明顯,OVX+CGA組與OVX+CGA+KZ組骨小梁數(shù)差別不明顯。(2)對micro-CT掃描細(xì)微結(jié)構(gòu)參數(shù)(BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th)分析顯示:Sham組最高,與其余各組都有明顯差異,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05);OVX組和OVC+KZ組最低;與OVX組相比,OVX+Nnat組、OVX+CGA組、OVX+CGA+Nnat組及OVX+CGA+KZ組值明顯升高,其中OVX+CGA+Nnat組增加更明顯,差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。OVX組與OVX+KZ組之間差別不明顯,OVX+CGA組與OVX+CGA+KZ組之間差別不明顯。(3)q PCR檢測Nnat表達(dá)顯示:與OVX組相比,OVX+KZ組無明顯差異,差異無統(tǒng)計學(xué)意義,OVX+Nnat組、OVX+CGA組、OVX+CGA+Nnat組及OVX+CGA+KZ組值明顯升高,其中OVX+CGA+Nnat組增加更明顯,差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05);與OVX+CGA組相比,OVX+CGA+KZ組無明顯差異,差異無統(tǒng)計學(xué)意義,OVX+CGA+Nnat組Nnat表達(dá)明顯增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論:(1)Nnat表達(dá)增強(qiáng)能夠改善卵巢去勢小鼠的骨結(jié)構(gòu),提高卵巢去勢小鼠脛骨的BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th值。(2)綠原酸能上調(diào)卵巢去勢小鼠內(nèi)體的Nnat表達(dá),進(jìn)而提高卵巢去勢小鼠脛骨的BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th值。
【圖文】：

3.結(jié)果3.1 BMSCs 原代、傳代培養(yǎng)通過倒置顯微鏡觀察顯示：初始時原代 BMSCs 培養(yǎng)皿內(nèi)雜質(zhì)較多，表現(xiàn)大小不一，梭形形態(tài)不明顯。接種 4-6h 后 BMSCs 基本貼壁，24h 后可見貼壁細(xì)胞呈現(xiàn)梭形、多邊形等多種形態(tài)，其中以長梭形細(xì)胞為主；4-5 天后，BMSCs 細(xì)胞形成散在集落，細(xì)胞膜清晰，細(xì)胞體透亮，胞漿豐富，，核仁清晰，細(xì)胞突起突長變大，細(xì)胞開始增殖；7-9 天左右細(xì)胞數(shù)量明顯增多，貼壁細(xì)胞形態(tài)趨于一致呈長梭形。細(xì)胞集落增殖擴(kuò)大相互靠近并融合成片匯合至 85-95%，細(xì)胞與細(xì)胞間相互緊密貼合，呈簇狀或漩渦狀同向生長排列。進(jìn)行細(xì)胞傳代，傳代后細(xì)胞生長速度明顯增快，代謝旺盛，以 1:3 的比例接種 3-4 天后，其可增殖至 80%－90%，即可進(jìn)入下一次傳代擴(kuò)增。（見圖 2.1）

圖 2.2 流式細(xì)胞儀測細(xì)胞的表面抗原3.3 通過 micro-CT 分析各組股骨各項指標(biāo)的差異3.3.1 綠原酸改善卵巢去勢小鼠股骨干骺端骨微結(jié)構(gòu)從 Micro-CT 三維重建圖可以看出，與 Sham 組比較，OVX 組小鼠股骨干骺端骨小梁數(shù)量顯著減少；經(jīng)綠原酸干預(yù)后的小鼠（OVXT 組）股骨干骺端的骨小梁數(shù)量增加，但與 Sham 組比較仍有差異。（見圖 2.3）3.3.2 綠原酸增加卵巢去勢小鼠的 BMD 值小鼠在去除卵巢后，由于缺乏雌激素，導(dǎo)致骨量減少，表現(xiàn)為 OVX 組小鼠的 BMD 值顯著低于 Sham 組小鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；在給去卵巢小鼠口服綠原酸后，骨丟失減少，表現(xiàn)為 OVXT 組小鼠的 BMD 值高于 OVX 組小鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）（圖 2.4），且與 Sham 組相比也存在一定的差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），結(jié)果表明綠原酸可以提高 BMD 值，
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R580

【參考文獻(xiàn)】

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1 周萍;李R

本文編號：2687832