【摘要】：目的:通過(guò)不同濃度葡萄糖和胰高血糖素(Glucagon,GC)處理MIN6細(xì)胞(胰島β細(xì)胞系),并在添加蛋白激酶A(Protein kinase A,PKA)信號(hào)通路刺激劑異丙腎上腺素(Isoprenaline,ISO)前后檢測(cè)PKA的變化及胰島素的分泌,進(jìn)一步探討PKA在GC促進(jìn)MIN6細(xì)胞胰島素分泌中的作用。方法:1.體外培養(yǎng)小鼠MIN6細(xì)胞并每天換液,當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到一定密度后傳代用于實(shí)驗(yàn);2.將細(xì)胞分成三組,分別加入0mmol/L(無(wú)糖)、2.8mmol/L(低糖)和16.7mmol/L(高糖)三個(gè)葡萄糖濃度,在此基礎(chǔ)上分別設(shè)置0ng/L、500ng/L和1000ng/L三個(gè)濃度水平的GC進(jìn)行干預(yù),將對(duì)PKA表達(dá)敏感的AKR質(zhì)粒及空白質(zhì)粒PCDNA3.1用電穿孔轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)入MIN6細(xì)胞,利用融合了生物傳感器的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)技術(shù)在添加刺激劑ISO前后實(shí)時(shí)定量檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)PKA的變化;3.酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)分別檢測(cè)添加刺激劑ISO前后不同處理組的細(xì)胞上清液中胰島素的分泌量;4.收集數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果:1.基于FRET的生物傳感器技術(shù)檢測(cè)不同濃度葡萄糖環(huán)境下不同濃度GC干預(yù)對(duì)PKA的影響:(1)無(wú)糖時(shí):500ng/L GC階段較空白處理和0ng/L GC階段顯著上升,1000ng/L GC階段較空白處理和0ng/L GC階段顯著上升,ISO階段較各階段均顯著上升(P0.05);(2)低糖時(shí):0ng/L GC階段較空白處理階段顯著上升,500ng/L GC階段較空白處理和0ng/L GC階段顯著上升,1000ng/L GC階段較空白處理和0ng/L GC階段顯著上升,ISO階段較各階段均顯著上升(P0.05);(3)高糖時(shí):0ng/L GC階段較空白處理階段顯著上升,500ng/L GC階段較空白處理和0ng/L GC階段顯著上升,1000ng/L GC階段較空白處理和0ng/L GC階段顯著上升,ISO階段較各階段均顯著上升(P0.05);(4)不同濃度GC干預(yù)對(duì)PKA生成影響的比較:無(wú)糖組各濃度GC階段之間無(wú)顯著差異(P0.05),低糖組和高糖組1000ng/L GC階段均顯著高于500ng/L GC階段(P0.05);2.ELISA檢測(cè)不同濃度GC對(duì)各組細(xì)胞分泌胰島素的影響:(1)無(wú)ISO時(shí):無(wú)糖1組中,1000ng/L GC干預(yù)后高于500、0ng/L時(shí),500ng/L GC干預(yù)后高于0ng/L時(shí)(P0.05)。低糖1組中,1000ng/L GC干預(yù)后高于500、0ng/L時(shí),500ng/L GC高于0ng/L時(shí)(P0.05)。高糖1組中,1000ng/L GC干預(yù)后高于500、0ng/L時(shí),500ng/L GC干預(yù)后高于0ng/L時(shí)(P0.05);(2)添加ISO后:無(wú)糖2組中,1000ng/L GC干預(yù)后高于500、0ng/L時(shí),500ng/L GC干預(yù)后高于0ng/L時(shí)(P0.05)。低糖2組中,1000ng/L GC干預(yù)后高于500、0ng/L時(shí),500ng/L GC干預(yù)后高于0ng/L時(shí)(P0.05)。高糖2組中,1000ng/L GC干預(yù)后高于500、0ng/L時(shí),500ng/L GC干預(yù)后高于0ng/L時(shí)(P0.05);(3)添加ISO前后胰島素分泌量差值的比較:無(wú)糖時(shí),1000ng/L GC干預(yù)后高于0ng/L時(shí)(P0.05);低糖時(shí),1000ng/L GC干預(yù)后高于0ng/L時(shí),500ng/L GC干預(yù)后高于0ng/L時(shí)(P0.05);高糖時(shí),1000ng/L GC干預(yù)后高于500、0ng/L時(shí),500ng/L GC干預(yù)后高于0ng/L時(shí)(P0.05)。結(jié)論:1.GC以濃度遞增的形式通過(guò)增加MIN6細(xì)胞內(nèi)PKA的濃度來(lái)促進(jìn)胰島素分泌;2.添加刺激劑ISO后GC增加PKA及胰島素分泌的作用更加明顯,說(shuō)明GC促進(jìn)胰島素分泌的作用通過(guò)第二信使信號(hào)系統(tǒng)PKA通路途徑實(shí)現(xiàn);3.GC通過(guò)增加PKA的濃度促進(jìn)胰島素分泌的作用具有一定的葡萄糖依賴(lài)性。
【圖文】：

采用基于 FRET 的熒光生物傳感器技術(shù)測(cè)定第二信使 PKA 在 MIN6 細(xì)胞胰島素分泌中的作用及機(jī)制結(jié) 果(Results)1.MIN6 細(xì)胞在培養(yǎng)中的一般形態(tài)在倒置顯微鏡下觀察 MIN6 細(xì)胞的形態(tài)，長(zhǎng)梭形貼壁生長(zhǎng)，圖 1 所示為（放大倍數(shù)A 為 4×，B 為 10×，C 為 20×）第 6 代在培養(yǎng)的細(xì)胞。

采用基于 FRET 的熒光生物傳感器技術(shù)測(cè)定第二信使 PKA 在 MIN6 細(xì)胞胰島素分泌中的作用及機(jī)制圖 2 轉(zhuǎn)染后 MIN6 細(xì)胞熒光蛋白的表達(dá)Fig 2 Expression of Fluorescent Protein in Transfected MIN6 Cells在激光共聚焦顯微鏡下，定位單個(gè)細(xì)胞后用油鏡觀察，按照表 4 設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)范圍后，開(kāi)始采集熒光圖像，，如圖 3（放大倍數(shù) 20×）：A、B、C 分別為 CFP、YFP、FRET 現(xiàn)象的熒光圖像。
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R587.1;TP212.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2684182