【摘要】：糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一種以持續(xù)的高血糖為基本特征的慢性全身性代謝疾病,是由于多種病因引起的胰島素抵抗或胰島素分泌絕對(duì)或相對(duì)不足而引起血糖升高的代謝紊亂性疾病。胰島素是胰腺β細(xì)胞合成的一種調(diào)節(jié)血糖的激素,除了降低血糖外,胰島素還可以抑制胰高血糖素的分泌。SP是速激肽家族的一員,是一個(gè)11個(gè)氨基酸的肽。SP可以直接發(fā)揮作用或與神經(jīng)激肽1(NK-1)受體結(jié)合后發(fā)揮其作用。SP也被發(fā)現(xiàn)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的痛覺(jué)敏感神經(jīng)遞質(zhì),作為外周組織的損傷信使和免疫調(diào)節(jié)劑。有研究表明,非肥胖糖尿病(NOD)小鼠注射SP后,胰島素抵抗,慢性炎癥胰島細(xì)胞和糖尿病癥狀被逆轉(zhuǎn)。GLP-1是一種主要由L細(xì)胞分泌的肽類物質(zhì),GLP-1在促進(jìn)胰島素的合成和分泌中起重要作用,它可以抑制β細(xì)胞凋亡,提高細(xì)胞的增殖和再生,減少胰高血糖素的分泌,延緩胃排空,減少食物的攝入,促進(jìn)外周組織和減少肝糖輸出,增加對(duì)葡萄糖的利用。GLP-1發(fā)揮降血糖作用是在較高血糖水平下,而在正常情況下則不起作用。這種葡萄糖濃度依賴的降糖特點(diǎn)顯著減少了在降糖過(guò)程中低血糖情況的發(fā)生,是一種新型安全有效的降糖方式。因此,尋找一種安全有效的提高GLP-1濃度的方法顯得尤為重要。在本研究中,我們研究了SP在大鼠胰島團(tuán)中的潛在功能。研究表明,SP作用于胰腺神經(jīng)系統(tǒng)與胰島α細(xì)胞的NK-1受體上。SP可能是治療糖尿病的一種很有前途的治療策略。實(shí)驗(yàn)材料及方法:第一部分:糖尿病大鼠胰腺內(nèi)P物質(zhì)的含量變化及其意義健康SD大鼠,體重200-250 g,高脂高糖喂養(yǎng)后注射STZ建立二型糖尿病大鼠模型。烏拉坦麻醉后分離胰腺,顯微解剖其胰腺神經(jīng)節(jié),免疫熒光雙染PGP9.5和SP(Substance P)。比較正常組和糖尿病組胰腺神經(jīng)節(jié)內(nèi)SP表達(dá)的變化。western blot和ELISA檢測(cè)正常組和糖尿病組胰腺內(nèi)SP蛋白表達(dá)的變化。第二部分:P物質(zhì)對(duì)胰島調(diào)控的研究分離純化大鼠胰島團(tuán),通過(guò)FDA/PI雙染來(lái)選出最優(yōu)的SP處理濃度后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。將其放入24孔板中培養(yǎng),分成4組:空白對(duì)照組、SP培養(yǎng)組、L-703,606處理組和L-703,606處理2小時(shí)后SP培養(yǎng)組,每孔20-30個(gè)胰島團(tuán)。用ELISA試劑盒來(lái)檢測(cè)胰島團(tuán)胰島素,GLP-1及胰高血糖素的分泌情況。并制作冰凍切片進(jìn)行NK-1R及α細(xì)胞免疫熒光染色。結(jié)果:第一部分:糖尿病大鼠胰腺內(nèi)P物質(zhì)的含量變化及其意義糖尿病大鼠胰腺神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中SP陽(yáng)性表達(dá)的占21.3%±1.7%,與正常大鼠性比較(34.0%±1.2%,n=13)有減少(p0.05)。糖尿病組SP表達(dá)為76.7±11.6%(n=5),對(duì)照組SP表達(dá)為103±10.7%(n=5),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。糖尿病組SP含量為1903.3±125.2 pg/ml(n=5),正常組SP含量為2989.72±101.3 pg/ml(n=5),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。第二部分:P物質(zhì)對(duì)胰島調(diào)控的研究胰島團(tuán)分別用含有SP與不含有SP的培養(yǎng)基培養(yǎng)三天后,收集上清進(jìn)行Elisa檢測(cè)。加入SP培養(yǎng)后,SP處理組胰島素釋放量(3.6±0.2μIU/IEQ,n=5,p0.05)與空白組(2.8±0.3μIU/IEQ,n=5,)比較顯著升高,GLP-1分泌量(6.3±0.4 pM/IEQ,n=5,p0.05)與空白組(4.3±0.3 pM/IEQ,n=5)比較明顯增加,胰高血糖素分泌量(31.2±9.4 pM/IEQ,n=5,p0.05)與空白組(43.9±11.7 pM/IEQ,n=5)略有減少,但兩組間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在加入SP受體NK-1R抑制劑L-703,606后,胰島素釋放量(2.6±0.1μIU/IEQ,n=5,p0.05)與SP組(3.6±0.2μIU/IEQ,n=5,)比較顯著減少,GLP-1分泌量(4.2±0.5 pM/IEQ,n=5,p0.05)與SP組(6.3±0.4 pM/IEQ,n=5)比較明顯減少,胰高血糖素分泌量(22.8±6.4 pM/IEQ,n=5,p0.05)與SP組(31.2±9.3 pM/IEQ,n=5)相比略有減少,但兩組間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在SP條件下與低糖(2.7Mm)培養(yǎng)環(huán)境相比(2.6±0.7 pM/IEQ,n=3),高糖(16.7 Mm)條件下GLP-1分泌量(11.7±2.1 pM/IEQ,n=3,p0.05)明顯增加,且24小時(shí)之內(nèi)分泌量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)增加。免疫熒光結(jié)果顯示胰腺神經(jīng)系統(tǒng)與胰島有著密切的聯(lián)系,且在胰島α細(xì)胞上由NK-1受體的表達(dá)。結(jié)論:在糖尿病病理狀態(tài)下,胰腺與胰腺神經(jīng)節(jié)中的SP表達(dá)均減少。在胰島細(xì)胞中,SP對(duì)胰島細(xì)胞有保護(hù)作用且可以促進(jìn)其胰島素的分泌,可能的機(jī)制是通過(guò)作用于α細(xì)胞的NK-1受體促進(jìn)GLP-1的分泌導(dǎo)致。
【圖文】：

糖尿病大鼠胰腺神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元 SP 的表達(dá)（×200）。綠色熒光為 PGP9.5，標(biāo)記所有神經(jīng)元，紅色熒光為 SP，白色箭頭所指為胰腺神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元。3.2 正常大鼠與糖尿病大鼠胰腺內(nèi) SP 蛋白表達(dá)用 western blot 分析兩組大鼠胰腺內(nèi) SP 的蛋白表達(dá)異同。糖尿病大鼠胰腺內(nèi)SP 和正常大鼠比較有顯著的降低，結(jié)果顯示見圖 2。通過(guò)光密度值計(jì)算，糖尿病組 SP 表達(dá)為 76.7±11.6% (n=5)，對(duì)照組 SP 表達(dá)為 103±10.7% (n=5)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），結(jié)果顯示見圖 3。

. 糖尿病大鼠與正常大鼠胰腺內(nèi) SP 的表達(dá)蛋白灰度值比較。#：p<0.05 (n大鼠與糖尿病大鼠胰腺內(nèi) SP 含量ISA 法定量分析兩組大鼠胰腺內(nèi) SP 的蛋白含量變化，，結(jié)果顯示見胰腺內(nèi) SP 和正常組比較有顯著的降低，糖尿病大鼠胰腺內(nèi) SP5.2 pg/ml(n=5)，正常大鼠胰腺內(nèi) SP 含量為 2989.72±101.3 pg/ml學(xué)意義（P<0.05）。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R587.1

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本文編號(hào)：2680490