【摘要】：糖尿病神經(jīng)痛(diabetic neuropathic pain,DNP)是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥,對患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響。脊髓是軀體感覺信息整合的關(guān)鍵部位,研究顯示表達(dá)于脊髓背角的超極化激活環(huán)核苷酸門控(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated,HCN)通道及鉀氯聯(lián)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(K~+-Cl~-cotransporter 2,KCC2)參與了病理性疼痛的發(fā)生、發(fā)展。其中,HCN4通道大量表達(dá)于背角膠狀質(zhì)抑制性中間神經(jīng)元,KCC2亦高表達(dá)于脊髓膠狀質(zhì)神經(jīng)元,糖尿病神經(jīng)痛時(shí)HCN4通道激活所誘發(fā)的K~+外流是否調(diào)節(jié)KCC2功能,繼而影響背角抑制性中間神經(jīng)元γ-氨基丁酸(GABA)的釋放及痛敏,均有待闡明。本課題通過制作大鼠糖尿病神經(jīng)性疼痛模型,觀察:1)脊髓背角HCN4通道在糖尿病神經(jīng)痛中的作用;2)KCC2是否參與HCN4通道對糖尿病神經(jīng)痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用。本課題探討脊髓背角HCN4通道在糖尿病神經(jīng)痛發(fā)生中的作用及機(jī)制,為開發(fā)以HCN4通道為靶點(diǎn)的新型鎮(zhèn)痛藥提供理論基礎(chǔ)。目的:1.觀察脊髓背角HCN4通道在糖尿病神經(jīng)痛中的作用。2.觀察KCC2是否參與HCN4通道對糖尿病神經(jīng)痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用。方法:1.4~5周齡SD大鼠隨機(jī)分為3組(n=12):(1)對照組;(2)STZ組(鞘內(nèi)給予生理鹽水);(3)ZD7288+STZ組(鞘內(nèi)給予HCN通道拮抗劑ZD7288)。單次腹腔注射60 mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)制備大鼠糖尿病模型,注射STZ 2 w后鞘內(nèi)給予HCN通道拮抗劑ZD7288。分別于造模前及造模后14、21、28 d測定大鼠空腹血糖和體重;行為學(xué)檢測機(jī)械縮足閾值(mechanical withdrawal threshold,MWT)及熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency,TWL);免疫印跡技術(shù)檢測大鼠脊髓背角HCN4通道、谷氨酸脫羧酶65(glutamate decarboxylase 65,GAD65)及KCC2蛋白的表達(dá);鄰苯二甲醛柱前衍生高效液相色譜法檢測大鼠脊髓背角GABA含量。2.4~5周齡SD大鼠隨機(jī)分為5組(n=12):(1)對照組;(2)STZ組(鞘內(nèi)給予生理鹽水);(3)ZD7288+STZ組(鞘內(nèi)給予HCN通道拮抗劑ZD7288);(4)DIOA+STZ組(鞘內(nèi)給予KCC2抑制劑DIOA);(5)DIOA+ZD7288+STZ組(先鞘內(nèi)給予DIOA,10 min后再給予ZD7288)。單次腹腔注射60 mg/kg STZ制備大鼠糖尿病模型,注射STZ 2 w后鞘內(nèi)給予HCN通道拮抗劑ZD7288及KCC2抑制劑DIOA。測定各組大鼠MWT及TWL值,免疫印跡技術(shù)檢測大鼠脊髓背角HCN4通道蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1.與對照組相比,糖尿病大鼠體重明顯減輕(P0.01),空腹血糖值明顯升高(P0.01),鞘內(nèi)注射HCN通道拮抗劑ZD7288對糖尿病大鼠體重和空腹血糖無顯著影響(P0.05);大鼠腹腔注射STZ 2 w后MWT、TWL明顯縮短,產(chǎn)生糖尿病神經(jīng)痛,鞘內(nèi)給予ZD7288可顯著延長糖尿病大鼠的MWT、TWL(P0.01);糖尿病大鼠脊髓背角HCN4通道蛋白表達(dá)顯著增高(P0.01)、KCC2蛋白表達(dá)降低(P0.01)、GAD65表達(dá)無顯著變化(P0.05),鞘內(nèi)注射HCN通道拮抗劑ZD7288可顯著降低糖尿病大鼠脊髓背角HCN4表達(dá)、升高KCC2表達(dá)(P0.01);糖尿病大鼠脊髓背角GABA含量顯著增加(P0.05),鞘內(nèi)給予ZD7288可顯著降低背角GABA含量(P0.05)。2.鞘內(nèi)給予KCC2抑制劑DIOA可顯著降低糖尿病大鼠的MWT、TWL,促進(jìn)DNP的發(fā)生、發(fā)展(P0.01)。此外,預(yù)先鞘內(nèi)給予KCC2抑制劑DIOA可顯著抑制HCN通道拮抗劑ZD7288的鎮(zhèn)痛效應(yīng)(P0.01),并且可顯著升高糖尿病大鼠脊髓背角HCN4通道的表達(dá)(P0.01)。結(jié)論:1.脊髓背角HCN4通道表達(dá)增加促進(jìn)了糖尿病神經(jīng)痛的發(fā)生、發(fā)展。2.HCN4通道在糖尿病神經(jīng)痛中的作用可能與其抑制糖尿病大鼠脊髓背角神經(jīng)元KCC2表達(dá)所致的“GABA向興奮性轉(zhuǎn)化”密切相關(guān)。
【圖文】：

圖1 HPLC色譜圖A.空白液；B.GABA對照品；C.組織樣品液（1為GABA峰）Fig.1 The HPLC chromatogramA. Blank solution; B. GABA reference substance; C. Tissue sample solution（5）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸取GABA對照品儲(chǔ)備液，加入三蒸水稀釋成GABA終質(zhì)量濃度分別為10、15、25、50、100 μg/mL的系列溶液，衍生化處理后按“1.2.7（1）”項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣檢測，以GABA的峰面積（y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線y = 13.166x + 3.5073（r=0.9997），見圖 2。表明GABA在10 ~ 100 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性良好。

圖1 HPLC色譜圖白液；B.GABA對照品；C.組織樣品液（1為GABA峰Fig.1 The HPLC chromatogramsolution; B. GABA reference substance; C. Tissue sampl備對照品儲(chǔ)備液，加入三蒸水稀釋成GABA終質(zhì)/mL的系列溶液，衍生化處理后按“1.2.7（1）的峰面積（y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（x）為橫坐6x + 3.5073（r=0.9997），見圖 2。表明GABA良好。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R587.2

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6 梁U，

本文編號(hào)：2680410