【摘要】：研究背景及目的皮膚創(chuàng)面是糖尿病嚴(yán)重且常見的并發(fā)癥,難以愈合的下肢潰瘍更是患者截肢的重要原因。已有研究表明血管新生障礙是糖尿病創(chuàng)面難以愈合的關(guān)鍵因素。而內(nèi)皮集落形成細(xì)胞(ECFCs)由于其克隆性增殖能力,可分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞并在體內(nèi)外促進(jìn)血管形成而備受關(guān)注。但在糖尿病環(huán)境下,ECFCs顯示出數(shù)量減少及功能障礙。本小組前期研究發(fā)現(xiàn)高糖可誘導(dǎo)ECFCs衰老并下調(diào)Sirt7表達(dá)。同時(shí),國(guó)外學(xué)者采用喜樹堿誘導(dǎo)HEK293FT細(xì)胞衰老,發(fā)現(xiàn)核仁磷酸蛋白1(NPM1)的乙�；诫S著Sirt7水平的降低而增加。最近的研究表明利拉魯肽可以顯著降低糖尿病患者足潰瘍相關(guān)截肢的風(fēng)險(xiǎn)。為此,本文選擇ECFCs為研究對(duì)象,以Sirt7為切入點(diǎn):1.首先探索利拉魯肽適宜干預(yù)濃度,然后構(gòu)建裸鼠傷口模型并進(jìn)行ECFCs移植,以探討高糖及利拉魯肽干預(yù)對(duì)創(chuàng)面愈合及血管形成的影響。2.體外模擬糖尿病環(huán)境,觀察高糖誘導(dǎo)的ECFCs內(nèi)的衰老標(biāo)記蛋白30(SMP30)、核仁磷酸蛋白1(NPM1)乙�；郊皃53蛋白的變化并進(jìn)行利拉魯肽的干預(yù)。3.通過轉(zhuǎn)染過表達(dá)Sirt7慢病毒載體,以闡明Sirt7與SMP30、NPM1乙�；�、p53和ECFCs衰老的關(guān)系。研究方法采集健康成人外周血,通過密度梯度離心法分獲得單個(gè)核細(xì)胞,于EGM-2全套培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得ECFCs。摸索利拉魯肽最佳干預(yù)濃度后,將細(xì)胞隨機(jī)分為三組:正糖組(NG)(5.5mmol/L D-葡萄糖),高糖組(HG)(30mmol/L D-葡萄糖),高糖干預(yù)組(HG+Lira)(30mmol/LD-葡萄糖+100nmol/L利拉魯肽)。建立全層皮膚傷口模型后進(jìn)行CM-Dil標(biāo)記的ECFCs移植,觀察創(chuàng)面愈合速度及毛細(xì)血管密度。體外模擬糖尿病環(huán)境,細(xì)胞隨機(jī)分為三組:正糖組(NG)(5.5mmol/L D-葡萄糖),高糖組(HG)(30mmol/L D-葡萄糖),滲透壓組(OSM)(5.5mmol/L D-葡萄糖+24.5mmol/L甘露醇)。采用免疫印跡法檢測(cè)SMP30,NPM1乙�；�,p53的表達(dá)。利拉魯肽干預(yù)部分添加兩組:正糖干預(yù)組(NG+Lira)(5.5mmol/L D-葡萄糖+100nmol/L利拉魯肽),高糖干預(yù)組(HG+Lira)(30mmol/LD-葡萄糖+100nmol/L利拉魯肽),檢測(cè)SMP30,NPM1乙�；�,p53的表達(dá)。慢病毒載體上調(diào)Sirt7表達(dá)后,在高糖暴露的情況下檢測(cè)過表達(dá)組以及空載體組的Sirt7,SMP30,NPM1乙�；�,p53的表達(dá),上述所有分組干預(yù)時(shí)間均為6天。研究結(jié)果1.高糖情況下,利拉魯肽的干預(yù)可上調(diào)Sirt7的表達(dá),且在100nmol/L時(shí),Sirt7表達(dá)水平上升至平臺(tái)期。2.高糖組處理的ECFCs移植入小鼠體內(nèi)后,小鼠的毛細(xì)血管密度減少,延遲創(chuàng)面愈合,而利拉魯肽的干預(yù)可增加毛細(xì)血管密度,促進(jìn)創(chuàng)面愈合。此外,在小鼠的血管結(jié)構(gòu)處觀察到移植前用CM-Dil標(biāo)記呈紅色的ECFCs,提示移植入的ECFCs摻入小鼠的脈管系統(tǒng)。3.高糖可增加ECFCs衰老,上調(diào)NPM1乙�；郊皃53表達(dá)。利拉魯肽干預(yù)及慢病毒上調(diào)Sirt7表達(dá)后,可減少ECFCs衰老,下調(diào)NPM1乙�；郊皃53表達(dá)。結(jié)論高糖可誘導(dǎo)ECFCs衰老,導(dǎo)致創(chuàng)面血管形成減少,延遲創(chuàng)面愈合。其機(jī)制可能與高糖減少Sirt7表達(dá),從而增加NPM1乙�；�,上調(diào)p53,促進(jìn)ECFCs衰老有關(guān)。而給予利拉魯肽后,通過上調(diào)Sirt7,逆轉(zhuǎn)上述通路的發(fā)生,從而減少高糖誘導(dǎo)的ECFCs衰老,增加血管形成,促進(jìn)創(chuàng)面愈合。
【圖文】：

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文采用單因素方差分析，組間進(jìn)一步兩兩分析采用 Turkey 法T 檢驗(yàn)，設(shè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，p＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義魯肽濃度梯度實(shí)驗(yàn)前期工作發(fā)現(xiàn)，高糖顯著下調(diào) Sirt7 表達(dá)。在高糖（30mmol/利拉魯肽（0-125nmol/L）共培養(yǎng) 6 天后，采用 Western bl圖 1 可見，Sirt7 的表達(dá)隨著利拉魯肽干預(yù)濃度的升高，也 0nmol/L 組相比，其表達(dá)在 50nmol/L、75nmol/L、100nmol/L（p<0.05），且在 100nmol/L 達(dá)到平臺(tái)期，因此，干預(yù)濃。

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文點(diǎn)小鼠傷口的愈合情況如圖 2A 所示，在第 3,5 和 7 天，高糖組的創(chuàng)面愈合速度明顯低于正糖組的速度（P <0.05）。此外，對(duì)第 14 天收獲的傷口組織切片進(jìn)行 CD31染色以測(cè)量毛細(xì)血管密度。如圖 2B 所示，同樣地，高糖組的毛細(xì)血管密度顯著低于正糖組。以上結(jié)果說明經(jīng)高糖干預(yù)的 ECFCs 可減少小鼠體內(nèi)的血管形成。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R587.2

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本文編號(hào)：2678791