【摘要】：研究目的:類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種常見的炎癥性關節(jié)炎,特征是炎性滑膜炎,目前機制尚未明確。腫瘤壞死因子α(TNF-α)是目前被認為參與炎癥反應最重要的細胞因子,抑制TNF-α是目前治療RA的主要手段,但其治療方法存在局限性,副作用多且價格昂貴;并且臨床中上市一種新藥物需要耗費大量的時間與金錢。因此快速高效的尋找一種新的療效好且安全的藥物是目前亟待解決的問題。在這種情況下,我們采用“老藥新用”的方法,旨在從己上市的藥物中發(fā)現(xiàn)并賦予其新的治療指征。研究方法:在篩選中,我們分別使用了穩(wěn)轉NF-κB β內(nèi)酰胺酶報告基因的THP-1細胞系、瞬轉NF-κB熒光素酶報告基因的RAW264.7細胞系和TNF-tg、NF-κB熒光素酶雙表達的轉基因小鼠作為工具篩選了 987種FDA已批準的藥物,經(jīng)過體內(nèi)外3輪篩選,我們找到了兩種可能抑制TNF-α活性的藥物:非索非那定(Fexofenadine,FFD)和特非那定(Terfenadine,TFD)。在體外驗證中,我們首先采用RNA-seq技術檢測了全基因的表達變化,并通過轉錄因子分析的方式明確藥物所干預的轉錄因子為NF-κB;我們同時應用ELISA和qRT-PCR等實驗,在3種不同的細胞系中檢測了 TNF-α下游炎癥因子(IL-1β、IL-6和NOS-2)的表達改變;為了更加確認藥物對NF-κB的作用,我采用免疫熒光、EMSA和Western blot等技術檢測分別檢測了NF-κB的轉位及結合活性。在體內(nèi)實驗中,我們采用了兩種類風濕性關節(jié)炎模型:TNF過表達(TNF-ααtransgentic,TNF-tg)轉基因小鼠自發(fā)性關節(jié)炎模型和膠原誘導關節(jié)炎(Collagen induced arthritis,CIA)模型。每種模型分別設立了預防實驗及治療實驗組,每天觀察、評分并口服灌胃給藥。處死小鼠后,首先通過多種行為學評分鑒定藥物治療效果;分別通過 HE 染色檢查小鼠關節(jié)處炎癥程度及軟骨下骨的破壞程度;用TRAP染色觀察骨質中破骨細胞的形成;且用Safranin O染色檢測關節(jié)表面軟骨的磨損;除此之外,我們利用micro-CT技術掃描了小鼠關節(jié)部分,更直觀的觀察小鼠骨質表面的骨破壞情況;最后通過ELISA的方法檢測了小鼠血清中炎癥因子的表達情況。在機制探究中,我們首先應用小干擾RNA技術敲減了組胺受體1,驗證并排除了 FFD和TFD對目前己知靶點的依賴性。然后通過流式細胞術和solid phase binding技術,排除了藥物是依賴抑制TNF-α與TNFR1受體結合發(fā)揮作用的可能。因此,我們考慮到藥物可能進入到細胞質中,然后結合了胞質中的蛋白產(chǎn)生作用。我們采用藥物親和反應靶點穩(wěn)定性測定(DARTS)實驗,即經(jīng)過蛋白酶消化、跑膠、考馬斯亮藍染色、質譜分析等技術找到了其可能的靶蛋白-胞漿型磷脂酶A2(cPLA2)。為了驗證該結果,我們設計并應用了細胞熱位移測定(CETSA)技術確認了該藥物與蛋白的結合反應。隨后我們利用了計算機模擬技術,即docking法對FFD和TFD在cPLA2蛋白上的的結合位點進行預測,然后對預測結果采用亞克隆技術和點突變技術進行了精確的驗證。最后,我們使用Western blot法對cPLA2的磷酸化進行檢測;且運用ELISA法對cPLA2的酶活性和其代謝產(chǎn)物花生四烯酸(AA)的產(chǎn)生進行了檢測,并設計了 AA干預實驗。最后,我們用crispr-cas9技術對FFD和TFD在治療作用中對cPLA2的依懶性進行了探究。實驗結果:1.在第一輪篩選過程中,我們應用穩(wěn)定轉染細胞系,重復了 3次實驗,最終得到28種藥物進入第二輪篩選;第二輪換用瞬轉細胞篩選,再次排除20種藥物,剩余8種藥物;最后我們設計了第三輪動物篩選,給TNF-tg:NF-KB熒光素酶雙表達轉基因小鼠每天藥物灌胃治療一周后,通過小動物活體成像技術,以及排除了部分有毒或抗癌藥物后,成功篩選出2種可能藥物。最終:通過體內(nèi)外3輪篩選實驗,我們從987種FDA批準的藥物組成的藥物庫中篩選到了可以拮抗TNF-αα激活NF-κB的小分子化合藥物TFD和其活性產(chǎn)物FFD。其中TFD是第一代抗組胺藥物,FFD是第二代抗組胺藥物。2.為了驗證上述藥物的抗炎效果,首先,我們用RNA-seq技術檢測了TNF-α誘導及FFD或TFD干預治療后的巨噬細胞中的基因變化,我們發(fā)現(xiàn)TNF-α誘導的許多炎癥相關因子均可以被FFD和TFD抑制;轉錄因子分析結果證實:NF-κB可以被該藥物抑制。隨后,我們用3種不同的原代細胞或細胞系,檢測了 TNF-α和FFD或TFD干預后炎癥因子的表達情況,發(fā)現(xiàn)IL-1β和IL-6均在治療后下調;除此之外,為了探究藥物對NF-κB的影響,我們設計了NF-κB轉位及活性檢測,均發(fā)現(xiàn)FFD和TFD不僅可以抑制TNF-α誘導的NF-κB轉位,還抑制了 NF-κB的結合活性。3.我們同樣構建了2種炎癥性關節(jié)炎動物模型:TNF-tg白發(fā)性關節(jié)炎和CIA模型,這兩種模型均為模擬類風濕性關節(jié)炎的常用模型。通過每天對小鼠的治療和觀察以及行為學評分,我們發(fā)現(xiàn)藥物治療后小鼠的炎癥反應、腫脹程度均得到明顯改善,發(fā)病率也得到有效控制。此外,組織學染色的結果同樣發(fā)現(xiàn)藥物治療組的癥狀明顯輕于對照組:HE染色中炎癥細胞的數(shù)目明顯減少,軟骨下骨損傷也顯著減輕;TRAP染色中藥物治療組破骨細胞的數(shù)目明顯少于對照組;Safranin O染色中治療組關節(jié)表面軟骨細胞數(shù)目及軟骨層數(shù)均有所改善。Micro-CT技術更直觀的證明了藥物治療對骨質丟失的有效控制。血清中的炎癥因子同體外實驗一樣,均能夠被藥物明顯抑制。4.為了探究FFD與TFD的治療機制,我們首先排除了其對HIR1,即FFD和TFD已知靶蛋白在抗炎作用中的依賴性。實驗發(fā)現(xiàn):即使敲減了HIR1的表達,藥物仍能顯著抑制TNF信號。此外,我們通過流式細胞術和solid phase binding實驗證實FFD與TFD不能夠抑制TNF-a.與TNFR1的結合。由此我們推測,藥物可能穿過細胞膜進入細胞質,結合質蛋白并發(fā)揮作用。為此,我們采用DARTS實驗結合質譜分析,發(fā)現(xiàn)了cPLA2為其可能的作用靶點。經(jīng)過DARTS和CETSA等方法的聯(lián)合驗證,證實cPLA2確實為藥物結合靶點。隨后,我們采取分子對接預測(docking)的方法發(fā)現(xiàn):FFD與TFD在cPLA2上可能的結合位點為第505號氨基酸(ser505)。為了證明該預測的準確性,我們首先應用亞克隆技術(sub-clone)從PLA2G4A(轉錄翻譯cPLA2的基因名稱)的N端和C端開始,逐個敲除結構域,構建質粒并轉染后應用DARTS實驗證實:藥物結合的結構域為CD2(Catalytic domain 2),這與我們的預測結果一致。為了更進一步、更精確的證明,我們又采用點突變(site-directed mutagenesis)的技術將PLA2G4A的505號氨基酸(ser505)突變?yōu)閍1a,并再次用DARTS驗證,結果表明:突變后,藥物不能與cPLA2結合。因此我們得到結論:cPLA2是FFD和TFD作用的新靶點,且結合位點是CD2結構域上的ser505。5.FFD和TFD可以結合cPLA2,但是藥物的抗炎作用是否通過cPLA2?ser505是cPLA2上一個重要的磷酸化位點,我們首先驗證了 FFD與TFD是否影響cPLA2磷酸化,實驗結果證實:FFD和TFD可以顯著抑制cPLA2的磷酸化�；ㄉ南┧�(arachidonic acid,AA)作為cPLA2的酶解產(chǎn)物,是一個重要的致炎因子。通過對cPLA2的酶活檢測和其酶解產(chǎn)物AA含量的檢測,我們發(fā)現(xiàn)藥物可以抑制cPLA2的酶活性,同時減少AA的產(chǎn)生。反之,當我們用AA刺激細胞產(chǎn)生炎癥時,FFD和TFD的治療作用隨之消失。以上結果表明:藥物的作用靶點為cPLA2,對其下游產(chǎn)物誘導的炎癥無抑制作用。最后,我們通過對cPLA2的敲除證實了FFD和TFD對TNF-α的拮抗作用確實是依賴于cPLA2的。結論及意義:通過上述實驗:我們從987種FDA批準的藥物中發(fā)現(xiàn)了FFD和TFD可以作為抑制TNF-αα的小分子化合物。經(jīng)過多種體外實驗和兩種動物模型的驗證,明確了其抑制TNF-α活性的作用。另外,我們發(fā)現(xiàn)了其新的靶蛋白cPLA2。并且該抗炎作用是依賴于cPLA2發(fā)揮作用。在此實驗中,我們發(fā)現(xiàn)了 FFD和TFD是TNF-α的拮抗劑,能夠用來治療各種由TNF-cα導致的疾病。一方面:FFD和TFD是一種小分子藥物,相比于蛋白類藥物、有更少的副作用、價格便宜、容易獲取、服用方便。另一方面:可以避免前三期臨床試驗,減少研發(fā)投入和時間。為臨床治療類風濕關節(jié)炎提供了新的思路和可能的方式。除此之外,我們同樣發(fā)現(xiàn):FFD和TFD也是cPLA2的抑制劑。因此,FFD和TFD不僅可以用來治療各類TNF-α相關的疾病,同樣可以用來治療cPLA2相關的疾病。
【圖文】：

３．結果逡逑３．１經(jīng)過第一輪篩選，我們發(fā)現(xiàn)了邋２４個藥物可以明顯抑制Ｐ內(nèi)酰胺酶的活性，即逡逑可以抑制ＴＮＦ－ａ活性（圖１－２）。逡逑？邐Ｔａｒｇｅｔｓ逡逑■２邋３０１邋？邋？？邋？？邋？逡逑（0邋？邋？邋？邋？邋？邋？邋？？？？邋？逡逑？邋？？？邋？？？邋？逡逑ｗ邋？邋？邋＊＊邋．邋？逡逑0■）？？？？？？、？邐＾邐邋—邋＊＿邋…邐２邐邐？邋．邋？邐邋．．邋．邋邐邐逡逑０邐２００邐４００邐６００邐８００逡逑圖１－２第一輪篩選結果。結果中第一個點為陽性對照組（ＴＮＦ－ａ組），圖中大多數(shù)逡逑藥物無法抑制ＴＮＦ－ａ活性，我們篩選出２４個藥物進入下一輪篩選（藍色區(qū)域）。逡逑本實驗藥物檢測均設置有一個復孔，且重復３次。逡逑３．２經(jīng)過第二輪篩選，大多數(shù)藥物仍然存在抗ＴＮＦ－ｃｘ活性。因為篩選出的藥物中逡逑存在抗癌藥、外用藥等毒性較大藥物，在排除了這些藥物后，仍有８個藥物可以逡逑明顯抑制熒光素酶的活性，即可以抑制ＴＮＦ－ａ活性（圖１－３）。逡逑１４逡逑

Ｎｅｇａｔｉｖｅ邋Ｖｅｈｉｃｌｅ邋ＤＡＢ邋ＤＢ邋ＦＦＤ邋ＴＦＤ邋ＤＮＢ邋ＣＢ邋ＢＣ邋ＰＥＮ逡逑ＦｆＦＰ＾ＰＰｉＰ，逡逑圖１－４第三輪藥物篩選結果。圖中第一只小鼠為陰性對照組（僅表達ｌｕｃ），第二逡逑只小鼠為陽性對照組（Ｖｅｈｉｃｌｅ治療），后面為不同藥物治療組。逡逑圖１－５邋ＦＦＤ與ＴＦＤ的分子結構圖。ＦＦＤ邋（左）是ＴＦＤ邋（右）的活性代謝產(chǎn)物，逡逑１５逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R593.22

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本文編號：2678788