發(fā)布時(shí)間：2020-05-23 20:56

【摘要】：目的:本研究充分利用貴州省燃煤污染型氟中毒病區(qū)資源,以細(xì)胞周期調(diào)控中關(guān)鍵分子p16基因?yàn)榍腥朦c(diǎn),檢測(cè)氟中毒人群p16基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)及甲基化水平的改變;同時(shí)構(gòu)建人成骨細(xì)胞氟中毒模型,檢測(cè)氟化鈉對(duì)人成骨細(xì)胞活力和細(xì)胞周期分布的影響,觀察p16基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)及甲基化水平改變,并進(jìn)一步使用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-AZA-dC進(jìn)行干預(yù),探討p16基因甲基化水平的改變?cè)诜前Y發(fā)生發(fā)展中的作用,為氟中毒防治提供新的思路與方向。方法:1燃煤污染型氟暴露人群研究1.1調(diào)查對(duì)象的選擇本研究依據(jù)地方性氟中毒病區(qū)劃分標(biāo)準(zhǔn)GB 17018-2011,選擇燃煤污染型氟中毒病區(qū)織金縣荷花村為調(diào)查點(diǎn),非氟中毒地區(qū)的安順市張官村作為對(duì)照點(diǎn);共篩選出調(diào)查對(duì)象380例(其中病例組295例,對(duì)照組85例)。1.2問(wèn)卷調(diào)查及生物樣本采集在知情同意原則下,進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查,并收集調(diào)查對(duì)象的生物樣本(血樣、尿樣)。1.3尿氟(Urinary fluorine,UF)檢測(cè)及分組采用氟離子選擇電極法測(cè)定尿氟含量,并根據(jù)所測(cè)得的UF濃度,將調(diào)查對(duì)象分為4組:①UF1.96 mg/gCr組,140 例;② 1.96 mg/gCr ≤ UF3.92 mg/gCr組,93 例;③ 3.92mg/gCr≤UF7.84 mg/gCr組,82例;④ UF≥7.84 mg/gCr組,65例。1.4氟骨癥診斷對(duì)荷花村295名調(diào)查對(duì)象進(jìn)行了前臂和小腿的X線檢查。并根據(jù)地方性氟骨癥診斷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)荷花村295名調(diào)查對(duì)象進(jìn)行了氟骨癥嚴(yán)重程度的評(píng)估,根據(jù)其X線表現(xiàn)分為:正常、輕度、中度、重度4組。1.5調(diào)查對(duì)象p16基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)及甲基化水平檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)調(diào)查對(duì)象外周血p16基因mRNA轉(zhuǎn)錄;酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)調(diào)查對(duì)象外周血P16蛋白表達(dá);甲基化敏感性高分辨率溶解曲線(MS-HRM)法檢測(cè)調(diào)查對(duì)象外周血p16基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平。2人成骨細(xì)胞氟中毒體外實(shí)驗(yàn)研究以0、125、250、500及1000 μmol/L NaF處理人成骨細(xì)胞72 h,建立氟中毒模型。在不同的染氟劑量組中,MTT法檢測(cè)人成骨細(xì)胞細(xì)胞活力;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布;qRT-PCR檢測(cè)p16基因mRNA轉(zhuǎn)錄;免疫印跡法(Western-blot,WB)檢測(cè)P16蛋白表達(dá);亞硫酸氫鹽測(cè)序PCR法(bisulfite sequencing PCR,BSP)檢測(cè)p16基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平。3 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-AZA-dC體外干預(yù)研究選擇劑量1000 μmol/L NaF處理人成骨細(xì)胞72 h,建立氟中毒細(xì)胞模型,根據(jù)MTT結(jié)果及參考文獻(xiàn),以5、10及20μmol/L 5-AZA-dC繼續(xù)處理細(xì)胞72 h。設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組(只染1000 μmol/L NaF)及不染毒空白對(duì)照組,建立5-AZA-dC干預(yù)模型。在不同劑量干預(yù)組中,BSP檢測(cè)p16基因甲基化水平;qRT-PCR檢測(cè)p16基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平;WB檢測(cè)P16蛋白表達(dá);MTT檢測(cè)細(xì)胞活力,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布。結(jié)果1燃煤污染型氟暴露人群研究隨UF濃度增加,p16基因mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)逐漸降低(χ2mRNA、蛋白=22.812、45.785,P均0.05),p16基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平逐漸增加(χ2=40.942,P0.05),同時(shí)氟骨癥的嚴(yán)重程度也逐漸增加(χ2= 16.791,P0.05)。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步分析了不同氟骨癥組中p16基因表達(dá)和甲基化水平差異,發(fā)現(xiàn)隨著氟骨癥的加重,p16基因表達(dá)逐漸降低(χ2mRNA、蛋白二8.535、15.963,P均0.05),p16啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平增加(χ2= 9.242,P0.05)。說(shuō)明p16基因啟動(dòng)子區(qū)的異常甲基化與氟暴露反應(yīng)有關(guān),可能參與了氟骨癥的發(fā)生發(fā)展。同時(shí),根據(jù)所測(cè)得甲基化水平,分為3個(gè)組:0-1%、1-12.5%和12.5-75%,發(fā)現(xiàn)隨著甲基化水平的升高,p16基因表達(dá)逐漸降低(χ2 mRNA、蛋白= 7.176、7.017,P均0.05),提示p16基因表達(dá)的下調(diào)與其甲基化有關(guān)。2人成骨細(xì)胞氟中毒體外實(shí)驗(yàn)研究隨著染氟劑量的增加,人成骨細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)逐漸升高(F=66.801,P0.05),處于G0/G1期細(xì)胞數(shù)逐漸減少,S期細(xì)胞逐漸增多,表明人成骨細(xì)胞在氟作用下加快了細(xì)胞進(jìn)入DNA的合成階段,表現(xiàn)出細(xì)胞增殖旺盛狀態(tài);隨NaF劑量的增加,p16基因表達(dá)呈逐漸下降趨勢(shì)(FmRNA、蛋白=41.663、49.844 P均0.05);p16基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平呈逐漸上升趨勢(shì)(χ2=73.034,P0.05)。3 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-AZA-dC體外干預(yù)研究不同劑量5-AZA-dC干預(yù)組中,隨著5-AZA-dC干預(yù)劑量的增加,p16基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平呈逐漸下降趨勢(shì)(χ2=97.695,P0.05),p16基因mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平呈逐漸升高趨勢(shì)(FmRNA、蛋白=42.850、30.560,P均0.05)。成骨細(xì)胞活力呈逐漸降低趨勢(shì)(F=40.455,P0.05),處于G0/G1期細(xì)胞數(shù)增加,而S期細(xì)胞逐漸減少,細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)呈逐漸降低趨勢(shì)(F=56.277,P0.05)。結(jié)論:1、氟暴露能夠通過(guò)誘導(dǎo)p16基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化進(jìn)而抑制了p1 基因mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá),導(dǎo)致了成骨細(xì)胞的增殖活躍,是氟致人成骨細(xì)胞增殖活躍的分子機(jī)制之一。2、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-AZA-dC能有效回復(fù)氟所致的p16基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化水平,回復(fù)p16基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),進(jìn)而逆轉(zhuǎn)氟所引起的人成骨細(xì)胞增殖活躍,為氟骨癥的治療研究帶來(lái)了新的思路。
【圖文】：

注：與 UF<1.96mg/gCr）組比較，，*P<0.05圖 1-4 不同 UF 水平 p16 基因 mRNA 轉(zhuǎn)錄表達(dá)4 Comparison of p16 mRNA expression in different 注：與 UF<1.96（mg/gCr）組比較，*P<0.05圖 1-5 不同 UF 水平 p16 基因蛋白表達(dá)

13注：與 UF<1.96（mg/gCr）組比較，*P<0.05圖 1-5 不同 UF 水平 p16 基因蛋白表達(dá) Comparison of P16 protein expression in different 16 啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平表達(dá)辨率熔解曲線分析（MS-HRM）
【學(xué)位授予單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R599.1

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本文編號(hào)：2677942