【摘要】：目的:本研究充分利用貴州省燃煤污染型氟中毒病區(qū)資源,以細胞周期調控中關鍵分子p16基因為切入點,檢測氟中毒人群p16基因轉錄表達及甲基化水平的改變;同時構建人成骨細胞氟中毒模型,檢測氟化鈉對人成骨細胞活力和細胞周期分布的影響,觀察p16基因轉錄表達及甲基化水平改變,并進一步使用DNA甲基轉移酶抑制劑5-AZA-dC進行干預,探討p16基因甲基化水平的改變在氟骨癥發(fā)生發(fā)展中的作用,為氟中毒防治提供新的思路與方向。方法:1燃煤污染型氟暴露人群研究1.1調查對象的選擇本研究依據(jù)地方性氟中毒病區(qū)劃分標準GB 17018-2011,選擇燃煤污染型氟中毒病區(qū)織金縣荷花村為調查點,非氟中毒地區(qū)的安順市張官村作為對照點;共篩選出調查對象380例(其中病例組295例,對照組85例)。1.2問卷調查及生物樣本采集在知情同意原則下,進行問卷調查,并收集調查對象的生物樣本(血樣、尿樣)。1.3尿氟(Urinary fluorine,UF)檢測及分組采用氟離子選擇電極法測定尿氟含量,并根據(jù)所測得的UF濃度,將調查對象分為4組:①UF1.96 mg/gCr組,140 例;② 1.96 mg/gCr ≤ UF3.92 mg/gCr組,93 例;③ 3.92mg/gCr≤UF7.84 mg/gCr組,82例;④ UF≥7.84 mg/gCr組,65例。1.4氟骨癥診斷對荷花村295名調查對象進行了前臂和小腿的X線檢查。并根據(jù)地方性氟骨癥診斷標準對荷花村295名調查對象進行了氟骨癥嚴重程度的評估,根據(jù)其X線表現(xiàn)分為:正常、輕度、中度、重度4組。1.5調查對象p16基因轉錄表達及甲基化水平檢測實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測調查對象外周血p16基因mRNA轉錄;酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測調查對象外周血P16蛋白表達;甲基化敏感性高分辨率溶解曲線(MS-HRM)法檢測調查對象外周血p16基因啟動子區(qū)甲基化水平。2人成骨細胞氟中毒體外實驗研究以0、125、250、500及1000 μmol/L NaF處理人成骨細胞72 h,建立氟中毒模型。在不同的染氟劑量組中,MTT法檢測人成骨細胞細胞活力;流式細胞術檢測細胞周期分布;qRT-PCR檢測p16基因mRNA轉錄;免疫印跡法(Western-blot,WB)檢測P16蛋白表達;亞硫酸氫鹽測序PCR法(bisulfite sequencing PCR,BSP)檢測p16基因啟動子區(qū)甲基化水平。3 DNA甲基轉移酶抑制劑5-AZA-dC體外干預研究選擇劑量1000 μmol/L NaF處理人成骨細胞72 h,建立氟中毒細胞模型,根據(jù)MTT結果及參考文獻,以5、10及20μmol/L 5-AZA-dC繼續(xù)處理細胞72 h。設陽性對照組(只染1000 μmol/L NaF)及不染毒空白對照組,建立5-AZA-dC干預模型。在不同劑量干預組中,BSP檢測p16基因甲基化水平;qRT-PCR檢測p16基因mRNA轉錄水平;WB檢測P16蛋白表達;MTT檢測細胞活力,流式細胞術檢測細胞周期分布。結果1燃煤污染型氟暴露人群研究隨UF濃度增加,p16基因mRNA轉錄及蛋白表達逐漸降低(χ2mRNA、蛋白=22.812、45.785,P均0.05),p16基因啟動子區(qū)甲基化水平逐漸增加(χ2=40.942,P0.05),同時氟骨癥的嚴重程度也逐漸增加(χ2= 16.791,P0.05)。在此基礎上,進一步分析了不同氟骨癥組中p16基因表達和甲基化水平差異,發(fā)現(xiàn)隨著氟骨癥的加重,p16基因表達逐漸降低(χ2mRNA、蛋白二8.535、15.963,P均0.05),p16啟動子區(qū)甲基化水平增加(χ2= 9.242,P0.05)。說明p16基因啟動子區(qū)的異常甲基化與氟暴露反應有關,可能參與了氟骨癥的發(fā)生發(fā)展。同時,根據(jù)所測得甲基化水平,分為3個組:0-1%、1-12.5%和12.5-75%,發(fā)現(xiàn)隨著甲基化水平的升高,p16基因表達逐漸降低(χ2 mRNA、蛋白= 7.176、7.017,P均0.05),提示p16基因表達的下調與其甲基化有關。2人成骨細胞氟中毒體外實驗研究隨著染氟劑量的增加,人成骨細胞增殖指數(shù)(PI)逐漸升高(F=66.801,P0.05),處于G0/G1期細胞數(shù)逐漸減少,S期細胞逐漸增多,表明人成骨細胞在氟作用下加快了細胞進入DNA的合成階段,表現(xiàn)出細胞增殖旺盛狀態(tài);隨NaF劑量的增加,p16基因表達呈逐漸下降趨勢(FmRNA、蛋白=41.663、49.844 P均0.05);p16基因啟動子區(qū)甲基化水平呈逐漸上升趨勢(χ2=73.034,P0.05)。3 DNA甲基轉移酶抑制劑5-AZA-dC體外干預研究不同劑量5-AZA-dC干預組中,隨著5-AZA-dC干預劑量的增加,p16基因啟動子區(qū)甲基化水平呈逐漸下降趨勢(χ2=97.695,P0.05),p16基因mRNA轉錄及蛋白表達水平呈逐漸升高趨勢(FmRNA、蛋白=42.850、30.560,P均0.05)。成骨細胞活力呈逐漸降低趨勢(F=40.455,P0.05),處于G0/G1期細胞數(shù)增加,而S期細胞逐漸減少,細胞增殖指數(shù)(PI)呈逐漸降低趨勢(F=56.277,P0.05)。結論:1、氟暴露能夠通過誘導p16基因啟動子區(qū)高甲基化進而抑制了p1 基因mRNA轉錄和蛋白的表達,導致了成骨細胞的增殖活躍,是氟致人成骨細胞增殖活躍的分子機制之一。2、DNA甲基轉移酶抑制劑5-AZA-dC能有效回復氟所致的p16基因啟動子區(qū)高甲基化水平,回復p16基因的轉錄表達,進而逆轉氟所引起的人成骨細胞增殖活躍,為氟骨癥的治療研究帶來了新的思路。
【圖文】：

注：與 UF<1.96mg/gCr）組比較，，*P<0.05圖 1-4 不同 UF 水平 p16 基因 mRNA 轉錄表達4 Comparison of p16 mRNA expression in different 注：與 UF<1.96（mg/gCr）組比較，*P<0.05圖 1-5 不同 UF 水平 p16 基因蛋白表達

13注：與 UF<1.96（mg/gCr）組比較，*P<0.05圖 1-5 不同 UF 水平 p16 基因蛋白表達 Comparison of P16 protein expression in different 16 啟動子區(qū)甲基化水平表達辨率熔解曲線分析（MS-HRM）
【學位授予單位】：貴州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R599.1

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本文編號：2677942