【摘要】：背景:隨著近年來糖尿病(Diabetes melitus,DM)發(fā)病率的升高,糖尿病性勃起功能障礙(Diabetes melitus induced Erectile dysfunction,DED)患者逐步成為一個龐大的群體,在男性性功能障礙性疾病中占有著相當大的比例。但基于DM對機體損傷機制的復雜性,以及DED發(fā)病機制與普通勃起功能障礙發(fā)病機制的差異性。DED的發(fā)病機制始終未能完全闡明。在眾多關于勃起功能障礙(Erectile dysfunction,ED)發(fā)生、發(fā)展機制的研究中,陰莖海綿體平滑肌細胞(Corpus cavernosum smooth muscle cells,CCSMCs)方面的探索起步相對較晚,卻展示出廣闊前景,可能為ED的診治帶來新思路。CCSMCs是陰莖海綿體最主要的組成成分,也是陰莖勃起過程中各種神經(jīng)-血管信號分子最終作用靶點,對陰莖海綿體微結構的維持至關重要。DED患者CCSMCs功能、形態(tài)、數(shù)量方面發(fā)生的改變也得以證實,但其機制目前尚不完全清楚。細胞自噬作為機體內(nèi)重要的清除代謝產(chǎn)物、促進細胞適應外界刺激的機制,已經(jīng)在多個領域內(nèi)被證實與機體器官結構重塑相關。在心血管方面,有大量研究認為糖尿病機體血管平滑肌微結構的改變與細胞自噬的參與有關,并且這種改變源自于自噬對血管平滑肌細胞(Vascular smooth musle cells,VSMCs)表型的調(diào)控。糖尿病機體CCSMCs中自噬現(xiàn)象已被證實,但其對于CCSMCs的作用及機制,目前研究的尚不夠深入。糖尿病誘導的CCSMCs自噬,是否具有同糖尿病機體VSMCs自噬相似的作用及作用機制,值得進一步證實,這可能為糖尿病性勃起功能障礙發(fā)病機制的探索提供新思路。目的:研究不同濃度葡萄糖水平對SD大鼠CCSMCs自噬水平及表型相關指標的影響,并初步探索二者之間的聯(lián)系。方法:(1)檢測不同濃度葡萄糖水平處理后CCSMCs自噬水平的變化:原代取材并培養(yǎng)CCSMCs,分別給予含25 mmol/L葡萄糖、30 mmol/L葡萄糖、45 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基處理細胞24 h。電鏡觀察自噬小體及自噬溶酶體,mFRP-GFP-LC3腺病毒轉染觀察各組自噬流情況,免疫熒光檢測LC3表達,Western blot檢測自噬相關蛋白LC3、P62、Beclin1表達;(2)探討不同濃度葡萄糖水平對CCSMCs表型相關指標的影響:對CCSMCs分別給予上述3個濃度水平的葡萄糖處理細胞24 h,利用免疫熒光、Western blot檢測CCSMCs表型相關蛋白α-SMA、hlcalponin、OPN表達,使用CCK-8試劑盒檢測各組細胞的增殖能力,劃痕實驗檢測其遷移能力;(3)探討不同濃度葡萄糖水平誘導的CCSMCs自噬與表型轉換的關系:根據(jù)前述處理后自噬及表型相關指標的變化,對所設置的幾個葡萄糖濃度組中,自噬及表型轉換現(xiàn)象均最明顯的30 mmol/L葡萄糖組,分別給予自噬抑制劑羥氯喹及3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)進行處理。使用Western blot及mFRP-GFP-LC3腺病毒轉染檢測各組細胞自噬相關指標的表達,Western blot檢測各組細胞平滑肌表型相關指標的表達。結果:(1)CCSMCs原代分離成功,電鏡、m FRP-GFP-LC3腺病毒轉染、免疫熒光、Western blot檢測結果均提示,不同濃度葡萄糖處理后各組細胞均可見不同程度自噬現(xiàn)象;給予高于常規(guī)培養(yǎng)濃度(25 mmol/L)的葡萄糖處理CCSMCs后,自噬水平升高,且30 mmol/L組最強(P0.05),45 mmol/L組回降(P0.05)。(2)給予高于常規(guī)培養(yǎng)濃度(25 mmol/L)的葡萄糖處理后,免疫熒光及Western blot均提示葡萄糖濃度為30 mmol/L、45 mmol/L時收縮型平滑肌標志蛋白α-SMA、hlcalponin表達量較25 mmol/L時減少(P0.05),合成型平滑肌標志蛋白OPN的表達較25 mmol/L時增多(P0.05),CCSMCs增殖能力(P0.05)、遷移能力亦有所增強;且這些改變在30 mmol/L葡萄糖組均比45 mmol/L葡萄糖組更為明顯(P0.05)。(3)給予Hydroxychloroquine、3-MA處理后,mFRP-GFP-LC3腺病毒轉染及Western blot均提示自噬流受阻;同時,Western blot結果提示給予兩種不同自噬抑制劑后,收縮型平滑肌標志蛋白α-SMA、hlcalponin表達量較30 mmol/L葡萄糖組有所回升(P0.05),合成型平滑肌標志蛋白OPN的表達較30 mmol/L時降低(P0.05),即CCSMC中葡萄糖誘導的表型轉換受到了抑制。結論:(1)常規(guī)培養(yǎng)條件下自噬存在于CCSMCs中,當給予更高濃度葡萄糖干預后自噬可進一步增強,但葡萄糖水平超過某一臨界值后自噬水平開始減弱;(2)葡萄糖濃度水平超過常規(guī)培養(yǎng)條件的葡萄糖濃度的后CCSMC發(fā)生表型轉換,且隨葡萄糖濃度變化的趨勢與細胞自噬水平隨葡萄糖濃度變化的趨勢一致;(3)抑制細胞自噬,葡萄糖誘導CCSMCs表型轉換受到抑制,說明葡萄糖誘導的CCSMC自噬可能參與了表型轉換過程。
【圖文】：

1.2 結果1.2.1 形態(tài)學及免疫熒光鑒定原代培養(yǎng)的 CCSMCs細胞經(jīng)原代取材傳代后(P3)光鏡下觀察形態(tài)，低倍顯微鏡下可見細胞束狀排列，，呈現(xiàn)峰-谷樣生長；高倍顯微鏡下可見絕大多數(shù)細胞呈現(xiàn)平滑肌細胞特有的梭形或紡錘狀（圖 1.1A）。免疫熒光結果提示α-SMA、hlcalponin 均呈現(xiàn)強陽性表達（圖 1.1B）。CCSMCs 原代培養(yǎng)成功。

12圖 1.2：免疫熒光檢測各組細胞 LC3Ⅱ的聚集A：免疫熒光檢測 LC3 表達;B:免疫熒光檢測 LC3 的定量分析;與 25 mmol/L 葡萄糖組相比,##P＜0.01;與 30 mmol/L 葡萄糖組相比,ΔΔP＜0.01;n=5。1.2.3 電鏡觀察不同濃度葡萄糖處理后細胞內(nèi)自噬小體及自噬溶酶體的形成不同濃度葡萄糖處理 CCSMCs 后，無論常規(guī)培養(yǎng)條件下還是給予超過常規(guī)培養(yǎng)濃度的葡萄糖，均有自噬小體及自噬溶酶體形成。但 30 mmol/L 葡萄糖組、45mmol/L 葡萄糖組自噬小體及自噬溶酶體總數(shù)均高于 25 mmol/L 葡萄糖組（P＜0.01），且 45 mmol/L 葡萄糖組較 30 mmol/L 葡萄糖組降低（P＜0.01）（圖 1.3）。
【學位授予單位】：湖北醫(yī)藥學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R587.1

【參考文獻】

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本文編號：2667729