【摘要】：背景:隨著近年來糖尿病(Diabetes melitus,DM)發(fā)病率的升高,糖尿病性勃起功能障礙(Diabetes melitus induced Erectile dysfunction,DED)患者逐步成為一個龐大的群體,在男性性功能障礙性疾病中占有著相當(dāng)大的比例。但基于DM對機(jī)體損傷機(jī)制的復(fù)雜性,以及DED發(fā)病機(jī)制與普通勃起功能障礙發(fā)病機(jī)制的差異性。DED的發(fā)病機(jī)制始終未能完全闡明。在眾多關(guān)于勃起功能障礙(Erectile dysfunction,ED)發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的研究中,陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞(Corpus cavernosum smooth muscle cells,CCSMCs)方面的探索起步相對較晚,卻展示出廣闊前景,可能為ED的診治帶來新思路。CCSMCs是陰莖海綿體最主要的組成成分,也是陰莖勃起過程中各種神經(jīng)-血管信號分子最終作用靶點(diǎn),對陰莖海綿體微結(jié)構(gòu)的維持至關(guān)重要。DED患者CCSMCs功能、形態(tài)、數(shù)量方面發(fā)生的改變也得以證實(shí),但其機(jī)制目前尚不完全清楚。細(xì)胞自噬作為機(jī)體內(nèi)重要的清除代謝產(chǎn)物、促進(jìn)細(xì)胞適應(yīng)外界刺激的機(jī)制,已經(jīng)在多個領(lǐng)域內(nèi)被證實(shí)與機(jī)體器官結(jié)構(gòu)重塑相關(guān)。在心血管方面,有大量研究認(rèn)為糖尿病機(jī)體血管平滑肌微結(jié)構(gòu)的改變與細(xì)胞自噬的參與有關(guān),并且這種改變源自于自噬對血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth musle cells,VSMCs)表型的調(diào)控。糖尿病機(jī)體CCSMCs中自噬現(xiàn)象已被證實(shí),但其對于CCSMCs的作用及機(jī)制,目前研究的尚不夠深入。糖尿病誘導(dǎo)的CCSMCs自噬,是否具有同糖尿病機(jī)體VSMCs自噬相似的作用及作用機(jī)制,值得進(jìn)一步證實(shí),這可能為糖尿病性勃起功能障礙發(fā)病機(jī)制的探索提供新思路。目的:研究不同濃度葡萄糖水平對SD大鼠CCSMCs自噬水平及表型相關(guān)指標(biāo)的影響,并初步探索二者之間的聯(lián)系。方法:(1)檢測不同濃度葡萄糖水平處理后CCSMCs自噬水平的變化:原代取材并培養(yǎng)CCSMCs,分別給予含25 mmol/L葡萄糖、30 mmol/L葡萄糖、45 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基處理細(xì)胞24 h。電鏡觀察自噬小體及自噬溶酶體,mFRP-GFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)染觀察各組自噬流情況,免疫熒光檢測LC3表達(dá),Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白LC3、P62、Beclin1表達(dá);(2)探討不同濃度葡萄糖水平對CCSMCs表型相關(guān)指標(biāo)的影響:對CCSMCs分別給予上述3個濃度水平的葡萄糖處理細(xì)胞24 h,利用免疫熒光、Western blot檢測CCSMCs表型相關(guān)蛋白α-SMA、hlcalponin、OPN表達(dá),使用CCK-8試劑盒檢測各組細(xì)胞的增殖能力,劃痕實(shí)驗(yàn)檢測其遷移能力;(3)探討不同濃度葡萄糖水平誘導(dǎo)的CCSMCs自噬與表型轉(zhuǎn)換的關(guān)系:根據(jù)前述處理后自噬及表型相關(guān)指標(biāo)的變化,對所設(shè)置的幾個葡萄糖濃度組中,自噬及表型轉(zhuǎn)換現(xiàn)象均最明顯的30 mmol/L葡萄糖組,分別給予自噬抑制劑羥氯喹及3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)進(jìn)行處理。使用Western blot及mFRP-GFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)染檢測各組細(xì)胞自噬相關(guān)指標(biāo)的表達(dá),Western blot檢測各組細(xì)胞平滑肌表型相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)。結(jié)果:(1)CCSMCs原代分離成功,電鏡、m FRP-GFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)染、免疫熒光、Western blot檢測結(jié)果均提示,不同濃度葡萄糖處理后各組細(xì)胞均可見不同程度自噬現(xiàn)象;給予高于常規(guī)培養(yǎng)濃度(25 mmol/L)的葡萄糖處理CCSMCs后,自噬水平升高,且30 mmol/L組最強(qiáng)(P0.05),45 mmol/L組回降(P0.05)。(2)給予高于常規(guī)培養(yǎng)濃度(25 mmol/L)的葡萄糖處理后,免疫熒光及Western blot均提示葡萄糖濃度為30 mmol/L、45 mmol/L時收縮型平滑肌標(biāo)志蛋白α-SMA、hlcalponin表達(dá)量較25 mmol/L時減少(P0.05),合成型平滑肌標(biāo)志蛋白OPN的表達(dá)較25 mmol/L時增多(P0.05),CCSMCs增殖能力(P0.05)、遷移能力亦有所增強(qiáng);且這些改變在30 mmol/L葡萄糖組均比45 mmol/L葡萄糖組更為明顯(P0.05)。(3)給予Hydroxychloroquine、3-MA處理后,mFRP-GFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)染及Western blot均提示自噬流受阻;同時,Western blot結(jié)果提示給予兩種不同自噬抑制劑后,收縮型平滑肌標(biāo)志蛋白α-SMA、hlcalponin表達(dá)量較30 mmol/L葡萄糖組有所回升(P0.05),合成型平滑肌標(biāo)志蛋白OPN的表達(dá)較30 mmol/L時降低(P0.05),即CCSMC中葡萄糖誘導(dǎo)的表型轉(zhuǎn)換受到了抑制。結(jié)論:(1)常規(guī)培養(yǎng)條件下自噬存在于CCSMCs中,當(dāng)給予更高濃度葡萄糖干預(yù)后自噬可進(jìn)一步增強(qiáng),但葡萄糖水平超過某一臨界值后自噬水平開始減弱;(2)葡萄糖濃度水平超過常規(guī)培養(yǎng)條件的葡萄糖濃度的后CCSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)換,且隨葡萄糖濃度變化的趨勢與細(xì)胞自噬水平隨葡萄糖濃度變化的趨勢一致;(3)抑制細(xì)胞自噬,葡萄糖誘導(dǎo)CCSMCs表型轉(zhuǎn)換受到抑制,說明葡萄糖誘導(dǎo)的CCSMC自噬可能參與了表型轉(zhuǎn)換過程。
【圖文】：

1.2 結(jié)果1.2.1 形態(tài)學(xué)及免疫熒光鑒定原代培養(yǎng)的 CCSMCs細(xì)胞經(jīng)原代取材傳代后(P3)光鏡下觀察形態(tài)，低倍顯微鏡下可見細(xì)胞束狀排列，，呈現(xiàn)峰-谷樣生長；高倍顯微鏡下可見絕大多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)平滑肌細(xì)胞特有的梭形或紡錘狀（圖 1.1A）。免疫熒光結(jié)果提示α-SMA、hlcalponin 均呈現(xiàn)強(qiáng)陽性表達(dá)（圖 1.1B）。CCSMCs 原代培養(yǎng)成功。

12圖 1.2：免疫熒光檢測各組細(xì)胞 LC3Ⅱ的聚集A：免疫熒光檢測 LC3 表達(dá);B:免疫熒光檢測 LC3 的定量分析;與 25 mmol/L 葡萄糖組相比,##P＜0.01;與 30 mmol/L 葡萄糖組相比,ΔΔP＜0.01;n=5。1.2.3 電鏡觀察不同濃度葡萄糖處理后細(xì)胞內(nèi)自噬小體及自噬溶酶體的形成不同濃度葡萄糖處理 CCSMCs 后，無論常規(guī)培養(yǎng)條件下還是給予超過常規(guī)培養(yǎng)濃度的葡萄糖，均有自噬小體及自噬溶酶體形成。但 30 mmol/L 葡萄糖組、45mmol/L 葡萄糖組自噬小體及自噬溶酶體總數(shù)均高于 25 mmol/L 葡萄糖組（P＜0.01），且 45 mmol/L 葡萄糖組較 30 mmol/L 葡萄糖組降低（P＜0.01）（圖 1.3）。
【學(xué)位授予單位】：湖北醫(yī)藥學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R587.1

【參考文獻(xiàn)】

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