【摘要】：第一部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬在氟致SD大鼠神經(jīng)毒性中的作用目的:過量氟暴露可產(chǎn)生神經(jīng)毒性,然而其具體機(jī)制仍不清楚。本研究旨在探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)與自噬在氟致SD大鼠神經(jīng)毒性中的作用,從而為闡明氟神經(jīng)毒性機(jī)制提供基礎(chǔ)依據(jù)。方法:40只SPF級Sprague-Dewley(SD)大鼠(180~220 g),隨機(jī)分為4組:對照組(水氟含量1 mg/L)以及水氟含量為10、50、100 mg/L氟化鈉(sodium fluoride,NaF)組,每組10只。各組大鼠通過自由飲水方式進(jìn)行染毒,每天觀察其進(jìn)食、飲水等一般情況,并記錄體重。染毒2個(gè)月后,通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測各組大鼠的學(xué)習(xí)及記憶能力;尼氏染色觀察大鼠海馬組織病理改變;電子透射顯微鏡觀察大鼠海馬組織超微結(jié)構(gòu);Western blot檢測大鼠海馬及皮層組織ERS及凋亡的關(guān)鍵蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)、需肌醇酶1α(inositol-requiring enzyme 1α,IRE1α)、含半胱氨酸的天冬氨酸酶-12(cysteine containing aspartate specific protease-12,Caspase-12)、含半胱氨酸的天冬氨酸酶-3(cysteine containing aspartate specific protease-3,Caspase-3)以及自噬關(guān)鍵蛋白選擇性自噬接頭蛋白P62/sequestosome 1、自噬體形成相關(guān)蛋白Beclin1及微管相關(guān)蛋白輕鏈3-β(microtubule-associated protein 1 light chain3-β,LC3)的蛋白表達(dá)水平;免疫組化檢測大鼠海馬及皮層中GRP78、Caspase-12及LC3的定位表達(dá)情況。結(jié)果:在Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)中,與同時(shí)間點(diǎn)對照組相比,100 mg/L NaF組大鼠游泳路程顯著增加(P0.05),且100 mg/L NaF組大鼠較對照組大鼠找到平臺(tái)的平均潛伏期顯著延長(P0.05);在空間探索實(shí)驗(yàn)中,100 mg/L NaF組大鼠穿越原平臺(tái)所在位置的次數(shù)明顯少于對照組(P0.05);此外,50和100mg/L NaF組大鼠在原平臺(tái)所在象限的活動(dòng)時(shí)間(路徑)與總時(shí)間(總路徑)比值均明顯低于對照組(P0.05)。尼氏染色結(jié)果顯示,對照組大鼠海馬組織CA3區(qū)神經(jīng)元內(nèi)尼氏小體數(shù)量豐富,而隨著NaF劑量的增加,海馬CA3區(qū)神經(jīng)元內(nèi)尼氏小體數(shù)量明顯減少。電子透射顯微鏡顯示對照組海馬神經(jīng)元核大,以常染色質(zhì)為主,而NaF組可見核皺縮,邊界不規(guī)則,染色質(zhì)濃集,并出現(xiàn)大量自噬小體及腫脹的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,50及100 mg/L NaF組大鼠海馬中GRP78蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P0.05),而各NaF組大鼠皮層中GRP78的蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P0.05);各NaF組大鼠海馬中IRE1α的蛋白表達(dá)水平顯著升高(P0.05),而50及100 mg/L NaF組大鼠皮層中IRE1α的蛋白表達(dá)水平顯著升高(P0.05);此外,各NaF組大鼠海馬中Cleaved caspase-12的蛋白表達(dá)水平顯著升高(P0.05),而50及100 mg/L NaF組大鼠皮層中Cleaved caspase-12的蛋白表達(dá)水平顯著升高(P0.05);各NaF組大鼠海馬及皮層中Cleaved caspase-3的蛋白表達(dá)水平顯著升高(P0.05)。與對照組相比,50及100mg/L NaF組大鼠海馬中自噬關(guān)鍵蛋白Beclin1、P62及LC3-(40)(40)蛋白表達(dá)水平顯著升高(P0.05);50及100 mg/L NaF組大鼠皮層中Beclin1以及各NaF組大鼠皮層的P62及LC3-(40)(40)蛋白表達(dá)水平顯著升高(P0.05)。免疫組化結(jié)果顯示,隨著NaF劑量的增加,大鼠海馬及皮層GRP78、Caspase-12及LC3蛋白的陽性細(xì)胞數(shù)均多于對照組,且隨著NaF劑量的增加,上述蛋白的陽性細(xì)胞數(shù)增多。結(jié)論:氟暴露可致SD大鼠神經(jīng)系統(tǒng)損傷,損害大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。此外,氟暴露可引起SD大鼠海馬及皮層發(fā)生ERS,并激活ERS介導(dǎo)的凋亡通路。同時(shí),氟暴露還可促進(jìn)SD大鼠海馬及皮層自噬體形成,但抑制自噬體降解,因此導(dǎo)致了SD大鼠海馬及皮層自噬流異常。綜上所述,ERS及自噬參與了氟致SD大鼠神經(jīng)系統(tǒng)的損傷過程。第二部分ERS及其介導(dǎo)的自噬在氟致SH-SY5Y細(xì)胞毒性中的作用目的:研究ERS及其介導(dǎo)的自噬在氟致人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞毒性中的作用,為探索氟致神經(jīng)毒性機(jī)制提供線索。方法:SH-SY5Y細(xì)胞暴露于不同濃度NaF(0、10、20及30 mg/L),通過Western blot技術(shù)檢測ERS及凋亡的關(guān)鍵蛋白GRP78、IRE1α、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)、Caspase-3,以及自噬關(guān)鍵蛋白Beclin1、P62及LC3的蛋白表達(dá)水平。ERS抑制劑4-苯基丁酸(4-Phenylbutyric acid,4-PBA)、自噬抑制劑渥曼青霉素(Wortmannin,Wort)、氯喹(chloroquine,CQ)或自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)提前處理細(xì)胞1 h后,NaF染毒24 h,然后通過Western blot技術(shù)檢測ERS及凋亡的關(guān)鍵蛋白GRP78、IRE1α、CHOP、Caspase-3,以及自噬關(guān)鍵蛋白Beclin1、P62及LC3的蛋白表達(dá)水平,采用免疫熒光技術(shù)檢測各組LC3熒光斑點(diǎn)聚集,并通過Cell Counting Kit-8(CCK-8)法檢測各組細(xì)胞存活率。結(jié)果:Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,30 mg/L NaF組中細(xì)胞中GRP78、IRE1α、Cleaved caspase-3、Beclin1及LC3-(40)(40)的蛋白表達(dá)水平顯著升高(P0.05),而20及30 mg/L NaF組細(xì)胞中CHOP及P62的蛋白表達(dá)水平顯著升高(P0.05)。4-PBA干預(yù)NaF染毒SH-SY5Y細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),與NaF組相比,4-PBA+NaF組細(xì)胞中IRE1α、CHOP、Cleaved caspase-3、P62及LC3-(40)(40)蛋白表達(dá)水平顯著降低(P0.05)。用自噬抑制劑干預(yù)后發(fā)現(xiàn),與NaF組比較,Wort+NaF組細(xì)胞中P62及LC3-(40)(40)蛋白表達(dá)水平顯著降低(P0.05),而CQ則進(jìn)一步加劇因NaF暴露而導(dǎo)致的P62及LC3-(40)(40)蛋白表達(dá)的升高(P0.05);自噬激動(dòng)劑Rapa干預(yù)NaF染毒SH-SY5Y細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),與NaF組比較,Rapa+NaF組細(xì)胞中P62蛋白表達(dá)水平顯著降低,而LC3-(40)(40)蛋白表達(dá)水平顯著升高(P0.05)。免疫熒光發(fā)現(xiàn)各組LC3熒光斑點(diǎn)聚集情況與各組LC3蛋白表達(dá)水平相一致。CCK-8法檢測上述各種干預(yù)后細(xì)胞存活率發(fā)現(xiàn),4-PBA干預(yù)可顯著升高NaF組細(xì)胞存活率(P0.05),此外,自噬干預(yù)劑Wort,CQ干預(yù)可顯著降低但Rapa干預(yù)可顯著升高NaF組細(xì)胞存活率(P0.05)。結(jié)論:一定劑量NaF可致SH-SY5Y細(xì)胞發(fā)生ERS及自噬流受損,抑制自噬致細(xì)胞存活率降低,而激活自噬可促進(jìn)細(xì)胞存活。此外,NaF引起的SH-SY5Y細(xì)胞ERS介導(dǎo)了自噬流受損的發(fā)生,抑制ERS可提高細(xì)胞存活率。
【圖文】：

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文露對大鼠體重和臟器系數(shù)的影響露時(shí)間延長及染毒劑量增加，50 及 100 mg/L NaF 組大鼠照組相比無顯著差異（P 0.05，見圖 1-1）；此外，與對照組大鼠卵巢系數(shù)及甲狀腺系數(shù)顯著升高（P < 0.05，見表 1-肝臟系數(shù)及腎臟系數(shù)與對照組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P 0

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文33大鼠逃避潛伏期顯著高于對照組（P < 0.05，圖1-2B）；此外，在PNT期間，同一天內(nèi)100 mg/L NaF組大鼠較對照組大鼠游泳路程顯著增加（P < 0.05，圖1-2C），訓(xùn)練第四天游泳軌跡見圖1-2D。圖1-2 氟對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響（n=10）注：（A）游泳速度；（B）逃避潛伏期；（C）游泳路程；（D）游泳軌跡圖；100mg/L NaF組與對照組比較，，#P < 0.05；同時(shí)間點(diǎn)，100 mg/L NaF組與對照組比較，*P < 0.05。2.2.2 氟暴露對大鼠記憶保持能力的影響在SPT中
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R599.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前9條

1 張亞樓;孫小娜;馮樹梅;李甜;廖禮彬;白生賓;鐘近潔;;過量氟引起成骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路的基因差異表達(dá)[J];重慶醫(yī)學(xué);2014年33期

2 朱玉龍;鄭玉建;呂小敏;馬艷;張杰;;氟對大鼠水迷宮學(xué)習(xí)記憶及腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)濃度的影響[J];新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2012年03期

3 劉艷潔;高勤;官志忠;;氟中毒對大鼠腦組織Ras-Erk1/2通路及轉(zhuǎn)錄因子CREB的影響[J];中國地方病防治雜志;2011年02期

4 邵千里,王亞南,李良文,李健;慢性氟中毒患者認(rèn)知功能缺損的初步研究[J];中國地方病學(xué)雜志;2003年04期

5 郭以河,趙梅蘭,彭瑞云,崔雪梅;尼氏小體染色方法的改進(jìn)及其在神經(jīng)病理學(xué)研究中的應(yīng)用[J];實(shí)用醫(yī)技雜志;2003年06期

6 梁友信,陳自強(qiáng);行為神經(jīng)毒理學(xué)方法的回顧與展望[J];中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志;1999年02期

7 李廣生;徐輝;井玲;;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在氟骨癥發(fā)生機(jī)制中的作用[J];中國地方病學(xué)雜志;2010年02期

8 魏娜;官志忠;;慢性氟中毒對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響[J];中國地方病學(xué)雜志;2013年03期

9 獨(dú)立;萬昌武;曹序茂;劉家騮;;慢性氟中毒對人胎腦發(fā)育的影響[J];中華病理學(xué)雜志;1992年04期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 雷蓉蓉;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在氟致神經(jīng)干細(xì)胞凋亡中的作用[D];華中科技大學(xué);2013年

本文編號(hào)：2667537