【摘要】：腸道菌群對宿主胃腸道、免疫以及神經(jīng)系統(tǒng)等均起著關(guān)鍵的作用,其甚至可以通過影響免疫系統(tǒng)來調(diào)節(jié)骨密度(Bone Mineral Density,BMD)。盲腸和大腸中的腸道菌群通過發(fā)酵不易在小腸中消化的膳食纖維或者抗性淀粉產(chǎn)生短鏈脂肪酸(Short Chain Fatty Acids,SCFAs),參與調(diào)節(jié)人體能量代謝,其中對于丁酸鈉(Sodium Butyrate,SB)的研究最為廣泛。SB除了為結(jié)腸上皮細(xì)胞提供能量,還是最早發(fā)現(xiàn)的組蛋白去乙�；敢种苿Ｆ湔{(diào)節(jié)能量攝入和利用,參與體重的控制。還通過影響腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡以及自噬在癌癥中起著重要的作用。骨質(zhì)疏松較常發(fā)生于髖部、股骨和腰椎,與骨組織的重建是密不可分的,是老年人致殘甚至是致死的主要原因之一。骨質(zhì)疏松中骨重建的不平衡,破骨細(xì)胞的形成和功能增加使得骨吸收大于骨形成。腸道菌群與骨骼健康之間存在著復(fù)雜而又緊密的聯(lián)系。SB因其組蛋白去乙�；敢种苿┑淖饔糜绊懝侵亟�,可以提高骨涎蛋白的以及骨保護(hù)素水平來刺激骨的形成,還能通過提高成骨細(xì)胞中骨橋蛋白的表達(dá)在早期抑制破骨細(xì)胞的分化。巨噬細(xì)胞是一種十分重要的免疫細(xì)胞,在人體各組織器官中均廣泛存在,破骨細(xì)胞由血系單核/巨噬細(xì)胞分化而成。RAW264.7是來源于小鼠的單核/巨噬細(xì)胞株,廣泛應(yīng)用于巨噬細(xì)胞的研究。本實(shí)驗(yàn)探討了不同濃度的SB對RAW264.7細(xì)胞自噬及破骨細(xì)胞分化的影響,CCK-8試劑盒檢測SB處理后RAW264.7細(xì)胞的活性,Hoechst33342染色檢測SB對RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞核的損傷,ROS及ATP試劑盒檢測SB處理RAW264.7細(xì)胞后ROS以及ATP表達(dá)水平的作用,設(shè)計(jì)引物檢測SB處理細(xì)胞后促炎因子的表達(dá),Cyto-ID試劑盒檢測SB對RAW264.7細(xì)胞自噬體的作用,蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)中使用了熒光酶標(biāo)儀、熒光顯微鏡、PCR儀以及流式細(xì)胞儀等檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果。數(shù)據(jù)顯示,SB劑量依賴性的影響細(xì)胞活性,0.25 m M SB使細(xì)胞活性顯著升高,1 m M及以上SB處理后細(xì)胞活性顯著降低,并使細(xì)胞核碎裂。細(xì)胞內(nèi)的ROS水平隨著SB處理濃度的升高呈劑量依賴性的先升高后有下降趨勢,2 m M時(shí)達(dá)到最高水平。ATP含量則隨著SB濃度的升高而減少。蛋白質(zhì)免疫印跡的結(jié)果顯示,1 m M SB減少了雷帕霉素靶蛋白(m TOR)的磷酸化,激活了自噬相關(guān)蛋白Unc-51樣激酶1(ULK1)以及Beclin-1,減少了線粒體分裂蛋白DRP1的磷酸化水平。隨著SB處理濃度的升高,組蛋白H3(Histone H3)的乙�；诫S之增加,細(xì)胞核內(nèi)p65蛋白的含量減少,凋亡蛋白Bcl-2樣蛋白4(Bax)以及被剪切的半胱天冬酶3(cleaved-caspase3)的表達(dá)增加。SB對巨噬細(xì)胞的研究之前主要集中在其炎癥的抑制作用上,本實(shí)驗(yàn)也檢測了炎癥因子的表達(dá),證明1 m M SB可以減少白介素-6以及白介素1βm RNA的表達(dá),表明SB或許可以在腸道中抑制腸道巨噬細(xì)胞的激活。而對于血系巨噬細(xì)胞,SB或許可以抑制其釋放促進(jìn)破骨分化的生長因子,減少破骨細(xì)胞生成。本論文利用RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的融合使其分化成為成熟的破骨細(xì)胞后,研究1 m M SB對破骨細(xì)胞的分化和功能的影響以及骨架的變化。對誘導(dǎo)后的破骨細(xì)胞進(jìn)行抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate Resistant Acid Phosphatase,TRAP)染色以及骨再吸收的分析、細(xì)胞骨架的熒光染色。結(jié)果顯示,1 m M SB減少了破骨細(xì)胞的數(shù)量以及骨再吸收形成的瘢痕,使細(xì)胞骨架發(fā)生了改變,F-肌動蛋白環(huán)被破壞。我們猜測SB或許通過核因子κB(Nuclear Factor kappa-B,NF-κB)信號通路的抑制作用減少成熟的破骨細(xì)胞的數(shù)量,從而減少骨吸收區(qū)域。SB對NF-κB信號通路的抑制作用還引起了細(xì)胞的凋亡,前體細(xì)胞株的凋亡也是破骨細(xì)胞減少的原因。另外,SB誘導(dǎo)的自噬水平的升高并未對破骨細(xì)胞的分化起到積極的作用,自噬機(jī)制對破骨細(xì)胞的影響還有待進(jìn)一步的研究。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,腸道菌群的代謝產(chǎn)物之一SB可以影響巨噬細(xì)胞以及成熟的破骨細(xì)胞,說明腸道菌群不僅自身可以通過影響腸道免疫系統(tǒng)改變骨質(zhì),還可以利用其代謝產(chǎn)物影響骨細(xì)胞。腸道菌群及其代謝物與骨組織之間的緊密聯(lián)系為預(yù)防以及治療骨質(zhì)疏松提供了新的思路。
【圖文】：

Imager 600 顯影。3.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用 GraphPad Prism 6.0、IBM SPSS 20.0 以及 Excel 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行因素方差分析。p<0.05 代表著這兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著性差異。4. 結(jié)果4.1 SB 劑量依賴性的抑制 RAW264.7 細(xì)胞的活性CCK-8 試劑盒檢測不同濃度 SB（0-4 mM）作用 24 h 對 RAW264.7 細(xì)胞活性的影響，結(jié)果顯示，，與對照組（0mM）相比，0.25mMSB 處理時(shí)細(xì)胞活性顯著增加了（P<0.05），隨著濃度的增加，從 1mM 開始 SB 對細(xì)胞的活性起明顯的抑制作用，2 mM SB 對細(xì)胞的抑制作用達(dá)到了約 50%，結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖 2-1. a）。a. b.

圖 2-2.SB 處理 RAW264.7 后細(xì)胞內(nèi) ROS 及 ATP 水平的變化。a.SB 劑量依賴性的誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的 ROS 水平（n=3；*p < 0.05)。b. SB 損耗細(xì)胞內(nèi)的 ATP（n=3；*p < 0.05)。Figure 2-2. The effect of SB on ROS and ATP levels in RAW264.7 cells. a. SB dose-dependentlyincrease the intracellular ROS levels (n=3; *p < 0.05). b. SB decreaseATPlevelin cells(n=3; *p < 0.05).4.3 SB 對 RAW264.7 細(xì)胞內(nèi) ATP 水平的影響沒有 ATP，我們所理解的生命就不可能存在，甚至細(xì)菌也依賴于與人類相同的 ATP 分子。ATP 水平降低促進(jìn)細(xì)胞釋放色素 c，增加了細(xì)胞的凋亡概率。ATP作為參與血管張力，突觸傳遞和細(xì)胞死亡的細(xì)胞外信號分子，細(xì)胞內(nèi) ATP 水平反映細(xì)胞活力，包括細(xì)胞存活，生長和形態(tài)。細(xì)胞內(nèi)的大部分 ATP 是在線粒體中產(chǎn)生的，細(xì)胞核和線粒體中基因的相互協(xié)調(diào)影響了 ATP 的產(chǎn)生。使用 ATP 試劑盒檢測不同濃度 SB（0-4 mM）處理 RAW264.7 細(xì)胞 24 h 對細(xì)胞內(nèi) ATP 水平的影響。結(jié)果與對照組（0 mM）相比，0.25 mM SB 處理后，ATP 水平略有升高，0.5mM-4mMSB 處理后 ATP 水平呈逐漸下降趨勢，結(jié)果具
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R580

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本文編號：2662237