【摘要】：目的:鹽酸益母草堿是一種提取自細葉益母草的鹽酸鹽水合物,根據(jù)之前的研究,鹽酸益母草堿具有多種的藥用價值,主要集中在婦產(chǎn)科疾病治療方面以及最新的心腦血管系統(tǒng)疾病診治方面。有實驗初步證明鹽酸益母草堿對原發(fā)性骨質(zhì)疏松有緩解作用,相關(guān)機制是通過抑制破骨細胞的增殖與分化而實現(xiàn),但鹽酸益母草堿對成骨細胞的具體相關(guān)機制尚未開展研究。本研究首次通過多種體內(nèi)與體外實驗方法研究鹽酸益母草堿對成骨細胞的作用,并探討可能存在的相關(guān)機制。研究方法:1、8周齡的雌性C57BL/6小鼠,體重在19-22克之間,在中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院本溪實驗中心SPF級動物飼養(yǎng)間進行飼養(yǎng)。適應性飼養(yǎng)一周后,將小鼠隨機分為三組,每組均為6只,分別為假手術(shù)組,骨質(zhì)疏松模型組,骨質(zhì)疏松模型+鹽酸益母草堿干預組。其中假手術(shù)組打開腹腔后,無任何其他操作僅將腹膜以及皮膚進行縫合。骨質(zhì)疏松模型組與骨質(zhì)疏松模型+鹽酸益母草堿干預組小鼠,打開腹腔后將雙側(cè)卵巢用6-0線進行結(jié)扎摘除,而后進行腹膜及皮膚縫合。術(shù)后一周骨質(zhì)疏松模型+鹽酸益母草堿干預組給予腹腔注射鹽酸益母草堿,劑量為15mg/Kg/d,假手術(shù)組與骨質(zhì)疏松模型組僅給予相同量的生理鹽水腹腔注射。干預8周后,進行骨密度檢測后,進行取材,選取股骨遠端與脛骨近端骨組織以及外周血進行檢測。2、通過對股骨遠端骨組織進行病理組織切片,用HE染色法檢測股骨遠端干骺端骨小梁的大體結(jié)構(gòu),并對組織切片進行免疫組織化學檢測,分別檢測成骨分化蛋白Runx2以及Wnt/β-catenin通路下游蛋白β-catenin的體內(nèi)骨骼組織中的表達情況。3、采用X線以及micro-CT方法檢測小鼠骨密度以及骨微結(jié)構(gòu)的改變情況。4、應用ELISA方法以及專用試劑盒,對采集的小鼠外周血進行骨鈣素以及堿性磷酸酶的檢測。5、利用CCK-8比色法檢測鹽酸益母草堿在體外對小鼠成骨前體細胞MC3T3-E1的細胞活力影響作用。6、采用堿性磷酸酶染色以及茜素紅染色檢測鹽酸益母草堿對小鼠成骨前體細胞MC3T3-E1分化以及礦化的作用。7、運用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測鹽酸益母草堿對體外小鼠成骨前體細胞MC3T3-E1的影響作用,主要指標包括Wnt/β-catenin通路一些關(guān)鍵蛋白(LRP5、GSK-3β、β-catenin)的mRNA表達情況,以及成骨細胞分化(ALP、Runx2、Osterix、Col1-α1)和骨成熟蛋白(OPG)的相關(guān)重要mRNA表達情況。8、運用蛋白免疫印跡法(Western blot法)檢測成骨細胞分化蛋白Runx2以及Wnt/β-catenin通路下游β-catenin以及磷酸化GSK-3β的蛋白表達情況。結(jié)果:1、骨質(zhì)疏松造模組骨密度較正常對照組骨密度顯著降低(P0.01),骨質(zhì)疏松造模組+鹽酸益母草堿較單純骨質(zhì)疏松造模組骨密度顯著提升(P0.01)。2、與假手術(shù)組相比,骨質(zhì)疏松造模組小鼠血清中骨鈣素(OCN)顯著降低(P0.01);較單純骨質(zhì)疏松造模組,骨質(zhì)疏松造模+鹽酸益母草堿組小鼠血清中骨鈣素有所提升(P0.01)。與此相似的結(jié)果,骨質(zhì)疏松造模組小鼠血清中堿性磷酸酶(ALP)水平較假手術(shù)組與骨質(zhì)疏松造模+鹽酸益母草堿組都明顯降低(P0.01),鹽酸益母草堿可以明顯提升骨質(zhì)疏松小鼠體內(nèi)堿性磷酸酶的表達(P0.01)。3、HE染色發(fā)現(xiàn)原發(fā)性骨質(zhì)疏松小鼠股骨遠端骨小梁數(shù)量與寬度明顯減少,間隔明顯加大。鹽酸益母草堿干預后可以使骨小梁稀疏程度明顯改善。4、免疫組織化學檢測顯示,與假手術(shù)組比較,骨質(zhì)疏松造模組β-catenin與Runx2股骨遠端骨骼組織病理切片中表達顯著降低(P0.01)。但骨質(zhì)疏松造模+鹽酸益母草堿組較骨質(zhì)疏松組β-catenin與Runx2明顯表達增多(P0.01)。5、Micro-CT檢測脛骨近端骨微結(jié)構(gòu)顯示,與假手術(shù)組相比,骨質(zhì)疏松模型組在骨小梁與總體積百分比(P0.01)、骨小梁面積與骨小梁體積百分比(P0.01)、骨小梁的寬度(P0.05)與數(shù)量上均明顯下降(P0.01),骨小梁的間隔寬度顯著上升(P0.01);而骨質(zhì)疏松模型+鹽酸益母草堿組,較骨質(zhì)疏松造模組比較,鹽酸益母草堿干預后顯著提升了骨小梁體積百分比與骨小梁的數(shù)量(P0.01),降低了骨小梁的間隔(P0.05)。6、通過CCK-8檢測鹽酸益母草堿對體外小鼠成骨前體細胞MC3T3-E1的活力影響,顯示100μmmol/L以下濃度的鹽酸益母草堿對MC3T3-E1細胞的增殖沒有明顯影響,100μmmol/L濃度,造成MC3T3-E1增殖速度明顯下降(P0.01)。7、堿性磷酸酶以及茜素紅染色顯示,鹽酸益母草堿(濃度為10μmmol/L,1μmmol/L)可以明顯促進體外MC3T3-E1細胞的堿性磷酸酶分泌及鈣化結(jié)節(jié)的產(chǎn)生。同時對MC3T3-E1細胞干預鹽酸益母草堿1天與5天后的堿性磷酸酶濃度進行檢測,顯示干預1天各組之間堿性磷酸酶濃度并無明顯差異,干預5天后10μmmol/L,1μmmol/L的益母草堿干預組堿性磷酸酶表達量顯著提升,統(tǒng)計學差異分別為(P0.01,P0.05)。8、RT-PCR檢測顯示給予體外MC3T3-E1細胞鹽酸益母草堿干預后,濃度為10μmmol/L的益母草堿干預組Wnt通路中相關(guān)重要節(jié)點基因LRP5、β-catenin的mRNA表達量顯著上升,不同濃度的益母草堿(濃度為10μmmol/L,1μmmol/L,0.1μmmol/L)干預后,有提示成骨分化的基因(ALP、unx2、Osterix、Col1-α1)不同程度地表達升高,而顯示骨成熟的基因OPG(骨保護素)不同濃度的益母草堿干預后表達亦表達升高。9、與假手術(shù)組相比,給予鹽酸益母草堿干預后,MC3T3-E1細胞系表達Wnt通路下游關(guān)鍵蛋白β-catenin以及磷酸化的p-GSK-3β明顯升高(10μmmol/L,1μmmol/L,P0.01),總GSK-3β表達無明顯差異。成骨分化重要蛋白Runx2表達顯著升高(10μmmol/L,1μmmol/L,0.1μmmol/L,P0.05)。結(jié)論:1、鹽酸益母草堿可以顯著提高原發(fā)性骨質(zhì)疏松小鼠的骨密度值。2、鹽酸益母草堿可以明顯增加原發(fā)性骨質(zhì)疏松小鼠干骺端附近骨小梁的數(shù)量以及減少骨小梁的平均間距,改善骨微結(jié)構(gòu),從而達到增加骨密度的作用。3、鹽酸益母草堿可以顯著提升原發(fā)性骨質(zhì)疏松小鼠血清中表達的骨鈣素水平以及堿性磷酸酶的表達。4、鹽酸益母草堿可以在小鼠體內(nèi)骨骼中增加Wnt/β-catenin通路下游蛋白β-catenin的表達以及成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2的表達,使成骨分化活動增加。5、鹽酸益母草堿可以在體外成骨細胞系中激活Wnt/β-catenin信號通路,上調(diào)LRP5、β-catenin蛋白和其mRNA的表達水平,同時提高GSK-3β的磷酸化水平以及比例。6、鹽酸益母草堿可以在體外提高成骨細胞系的MC3T3-E1的堿性磷酸酶活性及表達,促進成骨細胞的礦化過程。7、鹽酸益母草堿可以上調(diào)成骨細胞分化的相關(guān)基因(ALP、Runx2、osterix、Col1-α1)和成熟相關(guān)基因OPG的mRNA表達。
【圖文】：

麻醉下給予雌性8周齡C57BL/6小鼠進行雙側(cè)卵巢切除術(shù)

8圖 2，，HE 染色顯示各組小鼠股骨遠端干骺端附近骨小梁結(jié)構(gòu)。A 圖為假手術(shù)組，B 圖為骨質(zhì)疏松組，C 圖為骨質(zhì)疏松+鹽酸益母草堿組。淡粉色結(jié)締組織為骨小梁。（光鏡下 200X）
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R580

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本文編號：2662113