【摘要】：目的:肥胖是一種危害人類健康的世界性的疾病,其發(fā)病機(jī)制主要與代謝性慢性炎癥相關(guān),目前依然沒(méi)有找到一種安全有效的藥物能夠治愈肥胖。中藥木蝴蝶中提取的白楊素具有良好的抗肥胖功效,但作用靶點(diǎn)及機(jī)制仍不清楚。本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)及基因沉默篩選并驗(yàn)證白楊素抗肥胖的作用靶標(biāo),為其應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。方法:胰島素誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞,0.5mmol/L棕櫚酸建立脂肪細(xì)胞肥大模型,以50umol/L白楊素進(jìn)行干預(yù);雙向電泳分析正常組、模型組及白楊素組的差異蛋白,以液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜聯(lián)合飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)差異蛋白進(jìn)行鑒定,獲得候選靶標(biāo)蛋白;通過(guò)基因沉默、紫外光譜及熒光光譜分析確證白楊素抗肥胖的靶標(biāo)蛋白。結(jié)果:棕櫚酸組(模型組)中脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴形成較正常組及白楊素組明顯增加;雙向電泳得到各組蛋白質(zhì)譜后通過(guò)分析比較,得到在模型組中較正常組明顯增高或降低2倍及以上的蛋白點(diǎn)(p0.05),白楊素組中與正常組相差小于2倍的蛋白質(zhì)點(diǎn)共有8個(gè),液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜鑒定后得到8個(gè)蛋白,分別是T復(fù)雜蛋白1亞基ε(T-complex protein 1 subunit epsilon)、膜聯(lián)蛋白 A2(annexina2)、26S蛋白酶調(diào)節(jié)亞基8(26S protease regulatory subunit 8)、琥珀酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(Succinyl-CoA:3-ketoacid coenzyme A transferase 1)、熱休克蛋白 60(60 KDa heat shock protein)(在模型組中升高),以及T復(fù)合蛋白1亞基β(T-complex protein 1 subunit beta)、非均質(zhì)核核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein)及 14-3-3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白 epsilon 亞型(14-3-3 protein epsilon)(在白楊素組中降低)。飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行鑒定驗(yàn)證顯示,有4個(gè)蛋白鑒定結(jié)果與液質(zhì)聯(lián)用結(jié)果相同,分別是熱休克蛋白60、及膜聯(lián)蛋白A2、琥珀酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶以及T復(fù)雜蛋白1亞基ε。排除掉非特異性與細(xì)胞及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白點(diǎn),將候選蛋白鎖定為熱休克蛋白60、及膜聯(lián)蛋白A2、琥珀酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶及26S蛋白酶調(diào)節(jié)亞基8之中。通過(guò)基因沉默及甘油三酯驗(yàn)證結(jié)果顯示:將膜聯(lián)蛋白A2、熱休克蛋白60、及琥珀酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因(ANXA2、HSPD1以及SCOT1)沉默后,棕櫚酸誘導(dǎo)的3T3-L1細(xì)胞中甘油三酯形成分別減少30%,45%及40%(p0.05),而26S蛋白酶調(diào)節(jié)亞基8(PSMC5)沉默后甘油三酯未見(jiàn)減少。紫外光譜結(jié)果顯示,白楊素的加入可以使膜聯(lián)蛋白A2、熱休克蛋白60的肽鍵及絡(luò)氨酸特征峰處發(fā)生峰值增加及波長(zhǎng)的改變,但對(duì)琥珀酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的影響不明顯。除此之外,熒光光譜結(jié)果進(jìn)一步顯示,白楊素可與膜聯(lián)蛋白A2及熱休克蛋白60形成穩(wěn)定復(fù)合物以確定其藥物與靶標(biāo)之間的關(guān)系。結(jié)論:經(jīng)過(guò)篩選和驗(yàn)證,白楊素發(fā)揮抗肥胖的作用靶點(diǎn)是膜聯(lián)蛋白A2和熱休克蛋白60,其作用機(jī)制可能是白楊素分別對(duì)膜聯(lián)蛋白A2/MAPK通路及熱休克蛋白60/myd88通路發(fā)揮抑制作用,影響這兩個(gè)炎癥信號(hào)通路在脂肪細(xì)胞內(nèi)的激活,從而發(fā)揮抗肥胖作用。
【圖文】：

對(duì)灰度值相差大于等于２倍（Ｐ＜０．邋０５），白楊素組與模型組中灰度值相差大于等逡逑于２倍（Ｐ＜０．邋０５），白楊素組與正常組灰度值相差不大（Ｐ＞０．邋０５）的蛋白質(zhì)點(diǎn)，逡逑—共有８?jìng)�(gè)（如圖３所示），ＳＳＰ編號(hào)分別為１２０２，邋２４０２，１４０４，４５０３，，邋５５０２，逡逑９１０４，邋７５０１，邋７３０２。逡逑ｐＨ邋３邋邐？邋ｐＨ邋Ｋ）邋ｐＨ邋３邋邐？邋ｐＨ邋１０邋ｐＨ邋３邋邐？邋ｐＨ邋１０逡逑Ａ邐Ｂ邐．邋ｃ邐．邐｜邐＝逡逑■心拿灥：：ｉ逡逑＜４Ｐ｜Ｍｉｋｉ．邐ｍ邐？邐ｉｔｆ逡逑Ｊ２０？邐￣邐一邐NB．，．乻逡逑９１０４邐＊邐．邐９１０４邐服邐９１０４邐？逡逑？邐ｉ．ｉｉｉ｜ＳＰ邐．邐１ＳＫＩ）逡逑

本文編號(hào)：2660588