【摘要】：目的:自身免疫性甲狀腺疾病(AITDs)主要包括橋本甲狀腺炎(HT)和Graves病(GD),是常見的器官特異性自身免疫疾病。AITD的發(fā)生發(fā)展可能與遺傳和環(huán)境因素相關(guān),但是其具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚。代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)新興領(lǐng)域,研究對象多為相對分子量小于1kDa的小分子物質(zhì)。代謝組學(xué)的研究目的是測量疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)生改變的代謝途徑,并尋找與疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物。在人體內(nèi)的眾多代謝產(chǎn)物中,多胺是所有活細(xì)胞中不可缺少的聚合陽離子,多胺在甲狀腺生長以及核酸代謝過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。最常見的功能性多胺主要為腐胺(PUT)、精胺(SPM)和亞精胺(SPD)。多胺,特別是SPM和SPD在活細(xì)胞中發(fā)揮著重要的生理功能,包括離子通道的調(diào)節(jié)、基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯以及抗氧化損傷等。多胺代謝異常已被證實(shí)與多種自身免疫疾病有關(guān),包括多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。然而多胺在AITD發(fā)病中的作用及機(jī)制尚不清楚。因此,本研究旨在評估AITD患者和健康對照組血清和甲狀腺組織中多胺代謝產(chǎn)物水平,并預(yù)測甲狀腺激素、甲狀腺自身抗體、趨化因子、DNA/組蛋白整體甲基化水平以及AITD疾病進(jìn)展是否與多胺代謝相關(guān)。并進(jìn)一步在自發(fā)自身免疫性甲狀腺炎動(dòng)物模型NOD.H-2~(h4)小鼠實(shí)施多胺(精胺和亞精胺)干預(yù)治療,觀察多胺對自發(fā)性自身免疫性甲狀腺炎炎癥的影響以及抗體水平的變化,為臨床干預(yù)治療提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究方法:第一部分:收集98例AITD患者,包括33例HT患者,36例GD患者,29例甲狀腺抗體陽性(pTAb)患者和38例性別、年齡匹配的健康對照的外周血全血及血清。另收集20例HT患者的甲狀腺組織以及健康對照的甲狀腺組織20例。電化學(xué)免疫發(fā)光法檢測血清中游離T3(FT3),游離T4(FT4),促甲狀腺激素(TSH),甲狀腺球蛋白抗體(TgAb)及甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)。超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測血清以及甲狀腺組織中多胺含量。血清中進(jìn)行多胺代謝組學(xué)研究,共檢測14中多胺代謝產(chǎn)物,分別為多胺前體,多胺和多胺下游代謝產(chǎn)物。多胺前體主要包括S-腺苷甲硫氨酸(SAM),L-精氨酸(L-ARG),L-鳥氨酸(L-ORN)和賴氨酸(LYS);多胺包括腐胺(PUT),精胺(SPM),亞精胺(SPD),尸胺(CAD),胍丁胺(AGM),1,3-丙二胺(DAP),N-乙�；瘉喚�(NSPD),N-乙�；�(NPUT)和N-乙�；�(NSPM);γ-氨基丁酸(GABA)是腐胺的下級代謝產(chǎn)物。甲狀腺組織研究中主要檢測3種功能性多胺(PUT,SPM,SPD)。流式磁珠(CBA)技術(shù)檢測5種血清趨化因子(MCP-1,IP-10,IL-8,RANTES,MIG)。提取甲狀腺組織以及PBMC總RNA,real-time PCR檢測多胺代謝關(guān)鍵酶SSAT、SMS、SDS、ODC、AMD mRNA表達(dá)水平和DNA/H3K9甲基化關(guān)鍵酶DNMT1、G9A mRNA表達(dá)水平。酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測PBMC和甲狀腺組織中DNA和H3K9整體甲基化水平。第二部分:選取4周齡NOD.H-2~(h4)小鼠,隨機(jī)分為對照組(給予普通飲水)和高碘飲水組(給予1000倍高碘飲水)。高碘組給予1000倍高碘飲水8周后分為3組:甲炎補(bǔ)SPD組(SAT+SPD),甲炎補(bǔ)SPM組(SAT+SPM),甲炎組(SAT),每組10只。各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于補(bǔ)充多胺4周后麻醉處死并采集標(biāo)本。留取小鼠甲狀腺組織,HE染色觀察淋巴細(xì)胞浸潤情況。ELISA法測定小鼠血清甲狀腺球蛋白(TgAb)水平。超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測脾中SPM和SPD含量。ELISA檢測炎性細(xì)胞因子。real-time PCR檢測小鼠脾組織中多胺代謝關(guān)鍵酶SSAT、SMS、SDS、ODC、AMD mRNA表達(dá)水平。結(jié)果:第一部分:1、AITD患者血清中代謝組學(xué)研究共檢測了14種多胺代謝產(chǎn)物,GD和HT組呈現(xiàn)出許多類似的多胺代謝產(chǎn)物變化:GD和HT組血清中的L-ORN,L-ARG,LYS和AGM均明顯高于對照組(P0.05),而PUT,NPUT,SPM和DAP則顯著低于對照組(P0.05)。此外,GD和HT組相比于對照組也存在著些許多胺代謝模式的差異:GD組的SPD,NSPD,GABA明顯升高(P0.05),CAD水平明顯降低(P0.05);而HT的NSPM水平呈現(xiàn)出明顯降低(P0.05)。pTAb組相比于對照組僅表現(xiàn)為明顯降低的血清SPM和NSPM水平,其他代謝產(chǎn)物并未顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2、GD,HT和pTAb三組血清中的炎性趨化因子IP-10含量均明顯高于對照組;GD組較對照組呈現(xiàn)出高水平的MCP-1水平(P0.05),而HT和pTAb組的MCP-1較對照組并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3、所有AITD患者(GD,HT,pTAb)的SPM與SPD的比值(SPM/SPD)均顯著低于對照組,SPM/SPD與TPOAb呈現(xiàn)出強(qiáng)負(fù)相關(guān)(r=-0.569,P0.01)。4、logistic回歸分析顯示血清NSPD可能是單純抗體升高患者進(jìn)展為臨床甲減的危險(xiǎn)因素(OR=1.269;95%CI:1.023-1.574;P=0.031)。5、血清SPM與甲狀腺特異性抗體滴度(TPOAb和TgAb)呈負(fù)相關(guān)性。6、HT和GD組PBMC中的SSAT mRNA水平均明顯高于對照組;HT和GD組的SMS mRNA水平明顯低于對照組。7、HT患者甲狀腺組織中的SPM含量明顯低于對照組,且SPM與TPOAb呈明顯負(fù)相關(guān)性(r=-0.332,P0.05)。另外,HT患者的甲狀腺組織中SSAT mRNA水平明顯高于對照組(P=0.0190.05)。8、無論在PBMC還是甲狀腺組織中,各組DNA和H3K9整體甲基化水平及其關(guān)鍵酶(DNMT1和G9A)均較對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。第二部分:1、SAT組小鼠甲狀腺相對重量較對照組明顯增加(P0.05),SAT+SPD組小鼠的甲狀腺相對重量明顯低于同時(shí)點(diǎn)SAT組小鼠(P0.05),SAT+SPM組小鼠的甲狀腺相對重量與同時(shí)點(diǎn)SAT組未呈現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2、SAT組的血清TgAb滴度明顯高于對照組(P0.05)。SAT+SPD組的TgAb滴度明顯低于同時(shí)點(diǎn)SAT組(P0.05),SAT+SPM組的TgAb滴度與同時(shí)點(diǎn)SAT組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3、SAT+SPD組的組織學(xué)評分明顯低于SAT組(P0.05),SAT+SPM組與SAT組的組織學(xué)評分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。SAT+SPD組相比于SAT組可見到濾泡腔變小,但并未恢復(fù)到補(bǔ)碘前水平;濾泡上皮細(xì)胞及細(xì)胞核形態(tài)有所恢復(fù);淋巴細(xì)胞浸潤程度明顯減輕。SAT+SPM組淋巴細(xì)胞浸潤程度也有所減輕。4、SAT+SPD組的TNF-a、IL-12、IP-10顯著低于SAT組(P0.05)。SAT+SPM組的IL-12、IP-10明顯低于SAT組(P0.05)。5、SAT組的SSAT mRNA表達(dá)水平明顯高于對照組(P0.01)、SAT+SPD組(P0.01)以及SAT+SPM組(P0.05)。6、SAT組的精胺和亞精胺含量均明顯低于對照組(P0.05),補(bǔ)充SPD的甲炎小鼠脾組織中的SPD明顯高于SAT組(P0.05),補(bǔ)充SPM的甲炎小鼠脾組織中的SPM明顯高于SAT組(P0.05)。結(jié)論:1、GD和HT的大部分多胺代謝物表現(xiàn)出相似的模式,提示這兩種疾病之間可能存在共同的病理生理基礎(chǔ)或代謝途徑。2、NSPD可能是單純抗體升高進(jìn)展為臨床甲減的一個(gè)危險(xiǎn)因素(OR=1.269;95%CI:1.023-1.574;P=0.031),SPM是甲狀腺特異性抗體(TPOAb和TgAb)升高的保護(hù)因素(OR=0.988,95%CI=0.979-0.997,P=0.009)。3、SPM/SPD在GD,HT和pTAb組中均明顯減少,這意味著多胺的抗炎作用降低;同時(shí)SPM/SPD與TPOAb,IP-10呈負(fù)相關(guān),因此推測降低的SPM/SPD可能與炎癥的消耗有關(guān)。4、GD和HT的PBMC中多胺代謝酶SSAT表達(dá)上調(diào),精胺合酶SMS表達(dá)下調(diào)。HT患者甲狀腺組織中SSAT表達(dá)上調(diào)。SSAT表達(dá)異�？赡苁茿ITD患者血清和甲狀腺組織中多胺代謝異常的原因之一。5、雖然AITD患者外周血和甲狀腺組織中證實(shí)了出現(xiàn)多胺循環(huán)紊亂,但不足以導(dǎo)致DNA/組蛋白甲基化出現(xiàn)異常。6、SPD干預(yù)治療可以明顯減輕NOD小鼠碘致甲狀腺腫。補(bǔ)充SPD后NOD小鼠自身免疫甲狀腺炎的炎癥程度和血清TgAb水平明顯降低。7、補(bǔ)充SPD后小鼠脾組織中的TNF-a、IL-12、IP-10明顯降低,補(bǔ)充SPM組的IL-12、IP-10明顯降低;提示SPD、SPM具有抗炎作用。8、甲炎組小鼠的多胺關(guān)鍵酶SSAT mRNA水平明顯高于對照組,提示SAT的多胺代謝異常可能與SSAT表達(dá)異常有關(guān)。
【圖文】：

同時(shí)也是一種的常見的中樞抑制性神經(jīng) S-腺苷甲硫氨酸（SAM），L-精氨酸（L-ARG），LS）。SAM 脫羧成為 dcSAM 后參與到精胺和亞精胺DNA 或組蛋白發(fā)生甲基化的甲基供體，，因此 SAM調(diào)控[25]。L-精氨酸一方面會在精氨酸酶的作用下生的作用下生成腐胺；另一方面，精氨酸還會生成 N，能夠介導(dǎo)血管舒張，影響線粒體功能同時(shí)具有巨外源性補(bǔ)充精氨酸后會引起結(jié)腸和血液中的亞精胺胺的合成酶和代謝酶受多種因素的調(diào)節(jié)，包括氧化子等[29]。免疫細(xì)胞聚集在炎癥位點(diǎn)會產(chǎn)生促炎癥因轉(zhuǎn)錄因子 NF-κ B 和 NRF2 來影響多胺合成代謝酶[30]。機(jī)體通過嚴(yán)格的調(diào)控從而使多胺的合成和代謝

流式磁珠技術(shù)（CBA）檢測血清趨化因子 制備趨化因子標(biāo)準(zhǔn)品 (MCP-1，IP-10，IL-8，RANTES，MIG)）打開一瓶凍干的人趨化因子標(biāo)準(zhǔn)品轉(zhuǎn)移至 15ml 離心管中（標(biāo)注為最），加入 4ml 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，使用吸管輕柔混合，不可渦旋或劇烈混至少 15 分鐘。）準(zhǔn)備 8 只 15ml 離心管，分別標(biāo)注為：1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64，1，分別吸取 300ul 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液加入各離心管中。）吸取最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品 300ul 加入到 1：2 稀釋管中，使用吸管輕柔混 1：2 稀釋管中的 300ul 液體加入到 1：4 稀釋管中，依此類推（圖 2.BA 104.1 87.1 40 8 14二胺 117.1 100.1 35 9 14
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R581

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本文編號：2660778