【摘要】：背景:家族性高膽固醇血癥(Familial hypercholesterolemia,FH,OMIM#143890)是一種常見且嚴(yán)重的常染色體顯性單基因遺傳性疾病,以血漿總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇明顯升高、皮膚黃色瘤、早發(fā)冠心病為主要特征。FH是一種遺傳異質(zhì)性很高的疾病,基于家系樣本的致病基因定位策略已發(fā)現(xiàn)13個(gè)基因與膽固醇代謝紊亂有關(guān),包括LDLR、apoB-100、PCSK9、ABCG5和ABCG8等。傳統(tǒng)的研究認(rèn)為,FH主要的發(fā)病機(jī)制是致病基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)的相關(guān)突變引起蛋白結(jié)構(gòu)或功能改變,如LDLR基因突變,引起細(xì)胞膜表面的LDLR缺如或結(jié)構(gòu)功能異常,導(dǎo)致全身組織對(duì)血循環(huán)低密度脂蛋白利用障礙并在組織內(nèi)過度淤積。近年來的研究提示,蛋白質(zhì)編碼區(qū)的相關(guān)突變并不能說明FH全部的發(fā)病原因。因此,需要更深入的研究。RNA剪接(RNA splicing)是真核生物轉(zhuǎn)錄過程中的一個(gè)重要步驟,它將基因序列中的非編碼部分(內(nèi)含子)從序列中剪除,將編碼部分(外顯子)連接起來得到前體m RNA。異常剪接也會(huì)引起蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能改變,是疾病發(fā)生的一個(gè)常見原因。有相當(dāng)一部分突變位于非蛋白質(zhì)編碼區(qū)的內(nèi)含子區(qū)域,可能通過影響剪接模式而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。目前推測(cè),在單基因遺傳病中,大約1/3的變異會(huì)引起mRNA的異常剪接。因此,異常剪接是單基因遺傳病另一個(gè)重要的發(fā)病機(jī)制,需要一個(gè)系統(tǒng)的方案對(duì)異常剪接進(jìn)行篩查。RNA剪接廣泛存在于真核生物中,面對(duì)巨大而復(fù)雜的基因組數(shù)據(jù),僅利用傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法還不能滿足剪接位點(diǎn)的研究需要,這就迫切要求一種能精確計(jì)算預(yù)測(cè)剪接位點(diǎn)的生物信息學(xué)方法來指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。常用的剪接位點(diǎn)的預(yù)測(cè)方法有MaxEntScan,NNSPLICE和Net Gene2等。但是,這些方法對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果的解釋還沒有達(dá)成共識(shí),對(duì)于剪接位點(diǎn)評(píng)分解釋一致的截止值尚未確定,此外,對(duì)分析的序列長度有一定限制。本研究采用gkm-SVM方法對(duì)FH致病基因的剪接突變進(jìn)行篩查,評(píng)估這些突變是否會(huì)影響剪接。通過生物信息學(xué)理論方法篩查FH相關(guān)致病基因的剪接突變,將大大縮小實(shí)驗(yàn)范圍,為探索剪接機(jī)制提供了指導(dǎo)方向。目的:1.建立基于gkm-SVM剪接突變預(yù)測(cè)的方案。2.系統(tǒng)的篩查FH相關(guān)剪接突變。3.在細(xì)胞水平驗(yàn)證剪接突變對(duì)FH發(fā)生的作用。方法:1.從HS3D數(shù)據(jù)庫中獲得真實(shí)剪接位點(diǎn)和虛假剪接位點(diǎn)序列,按照一定的長度截取序列組成新的數(shù)據(jù)集。利用正集訓(xùn)練集和負(fù)集訓(xùn)練集對(duì)gkm-SVM模型進(jìn)行訓(xùn)練。利用測(cè)試集數(shù)據(jù)來檢驗(yàn)所建模型的正確性。從HGMD專業(yè)數(shù)據(jù)庫獲得78個(gè)致病的剪接突變,從ClinVar和1000基因組獲得53個(gè)良性多態(tài)性,用于評(píng)估gkm-SVM方法對(duì)剪接突變的預(yù)測(cè)效果,并與其它方法進(jìn)行比較。2.使用R語言中一個(gè)名為Shiny的R包,基于Shiny框架建立用戶可視化界面,方便用戶對(duì)剪接突變進(jìn)行預(yù)測(cè)。3.針對(duì)已有FH致病基因的突變篩查在剪接位點(diǎn)附近的剪接突變,利用gkm-SVM模型對(duì)FH相關(guān)剪接突變進(jìn)行預(yù)測(cè)。4.采用minigene技術(shù)對(duì)FH相關(guān)剪接突變進(jìn)行功能驗(yàn)證:構(gòu)建ABCG5基因的一個(gè)突變點(diǎn)IVS7+2 GA野生型和突變型質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,并提取細(xì)胞總RNA,進(jìn)行RT-PCR分析和測(cè)序。通過RT-PCR產(chǎn)物的電泳條帶以及測(cè)序鑒別其剪接結(jié)果。結(jié)果:1.建立了gkm-SVM剪接突變預(yù)測(cè)模型,對(duì)于供體位點(diǎn),正樣本識(shí)別率和負(fù)數(shù)樣本識(shí)別率分別達(dá)95.9%和89.9%,相關(guān)系數(shù)為0.8286;對(duì)于受體位點(diǎn),正樣本識(shí)別率和負(fù)數(shù)樣本識(shí)別率分別達(dá)86.6%和82.7%,相關(guān)系數(shù)為0.6653,說明gkm-SVM模型達(dá)到了較高的敏感性和特異性。對(duì)所建立的gkm-SVM模型進(jìn)行評(píng)估,ROC曲線分析結(jié)果表明無論是供體位點(diǎn)還是受體位點(diǎn),gkm-SVM方法都表現(xiàn)出了較好的預(yù)測(cè)性能。2.基于Shiny框架成功建立了預(yù)測(cè)剪接突變的可視化界面,方便用戶對(duì)感興趣的剪接突變進(jìn)行分析,評(píng)估突變對(duì)剪接的是否會(huì)產(chǎn)生影響。3.篩查FH相關(guān)剪接突變:篩選出LDLR基因剪接突變有108種,其它FH相關(guān)基因(apoB-100、PCSK9、ABCG5和ABCG8)的剪接突變總共有14種。4.瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,野生型質(zhì)粒所得的RT-PCR產(chǎn)物正常,條帶大小為295bp,而突變型沒有正常條帶,取而代之的是81bp的條帶。經(jīng)測(cè)序后證實(shí)突變型的目的條帶為81bp,成熟mRNA將整個(gè)外顯子8剪切掉,造成突變型質(zhì)粒所得的RT-PCR產(chǎn)物縮短。結(jié)論:1.本研究建立的gkm-SVM模型達(dá)到了較高的靈敏性和特異性。無論是供體位點(diǎn)還是受體位點(diǎn),gkm-SVM與其它方法比較都表現(xiàn)出了較好的預(yù)測(cè)性能。2.根據(jù)gkm-SVM的預(yù)測(cè)方案,對(duì)于供體位點(diǎn),84.1%的LDLR剪接突變可能對(duì)剪接造成影響,對(duì)于受體位點(diǎn),86.7%的LDLR剪接突變可能對(duì)剪接造成影響。3.采用minigene技術(shù),驗(yàn)證了ABCG5基因突變點(diǎn)IVS7+2 GA確實(shí)發(fā)生異常剪接,致使外顯子8缺失,進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能異常。
【圖文】：

圖 1-1 RNA 剪接示意圖剪接位點(diǎn)位于外顯子和內(nèi)含子之間的邊界，，包括供體位點(diǎn)和受體位點(diǎn)，是前-mRNA 內(nèi)的特殊核苷酸序列標(biāo)明的，這些序列指明了剪接應(yīng)該在何處進(jìn)。內(nèi)含子的 5’端的外顯子-內(nèi)含子邊界稱為 5’剪接位點(diǎn)（5’ss），又稱為供體點(diǎn)（donor site）。內(nèi)含子 3’端的內(nèi)含子-外顯子邊界稱為 3’剪接位點(diǎn)（3’ss）

供體位點(diǎn)示意圖
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R589.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳禎s

本文編號(hào)：2648347