【摘要】：目的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以滑膜增生、血管翳形成和炎性細(xì)胞浸潤為主要病理特征的系統(tǒng)性自身免疫病,最終可造成患者關(guān)節(jié)的破壞和畸形。RA滑膜因其中的缺氧微環(huán)境、細(xì)胞大量增生和侵襲表型被認(rèn)為是一種“腫瘤樣組織”。已知有成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等多種細(xì)胞參與RA的發(fā)病機(jī)制。其中,FLS在RA滑膜中遷移、侵襲和增殖能力的增加,是RA滑膜增生和侵襲性血管翳形成的基礎(chǔ)。有研究報道缺氧微環(huán)境可通過上調(diào)細(xì)胞骨架蛋白肌成束蛋白(fascin1,FSCN1)的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞的遷移與侵襲。本研究旨在探究RA滑膜缺氧微環(huán)境對FLS遷移和侵襲能力的影響及其可能的分子機(jī)制,為臨床治療或緩解RA病程提供新的靶點(diǎn)。方法1.本實(shí)驗(yàn)所用滑膜標(biāo)本均取自于2015年9月至2017年4月期間,行關(guān)節(jié)鏡和關(guān)節(jié)置換術(shù)的RA和骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)患者。其中,RA 8例,OA 15例。2.應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法檢測RA和OA滑膜中FSCN1和HIF-1α的表達(dá);應(yīng)用組織免疫熒光染色法分析RA和OA滑膜中FSCN1和HIF-1α表達(dá)的共定位;定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative polymerase chain reaction,q-PCR)檢測FSCN1和HIF-1α的mRNA在RA和OA滑膜中的表達(dá)情況。3.采用聯(lián)合酶消化法分離RA/OA FLS并體外培養(yǎng),分別應(yīng)用q-PCR和免疫印跡法(western blot,WB)檢測FSCN1的mRNA和蛋白在RA/OA FLS中的基礎(chǔ)表達(dá)。4.應(yīng)用氯化鈷造成實(shí)驗(yàn)性缺氧,模擬RA滑膜缺氧微環(huán)境。應(yīng)用q-PCR、WB和細(xì)胞免疫熒光染色法檢測實(shí)驗(yàn)性缺氧時RA FLS中HIF-1α表達(dá)的變化.5.應(yīng)用q-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測實(shí)驗(yàn)性缺氧時RA FLS中FSCN1表達(dá)的變化;應(yīng)用RNA干擾技術(shù)降表達(dá)RA FLS中的HIF-1α;應(yīng)用q-PCR和WB檢測RA FLS中siHIF-1α的干擾效率及FSCN1的表達(dá)。6.應(yīng)用Transwell法檢測實(shí)驗(yàn)性缺氧及siHIF-1α對RA FLS遷移和侵襲能力的影響;應(yīng)用MTT分析實(shí)驗(yàn)性缺氧對于RA FLS增殖能力的影響。7.應(yīng)用WB評估STAT3通路在“缺氧調(diào)控RA FLS遷移和侵襲”這一過程中的作用。8.計量資料以x±s表示,兩組資料間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);多組資料間比較采用單因素方差分析,再用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行組間多重比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行分析。結(jié)果1.病理學(xué)結(jié)果顯示,FSCN1和HIF-1α在RA滑膜高表達(dá),主要分布于滑膜襯里層和襯里下層的細(xì)胞聚集區(qū)域,且FSCN1和HIF-1α可見大量共定位,HIF-1α與細(xì)胞核有較好共定位;而OA滑膜中FSCN1和HIF-1α呈弱表達(dá)。q-PCR結(jié)果顯示,RA滑膜中FSCN1(4.4375±0.72780 vs.1.0000±0.51235,t=9.460,P0.001)和 HIF-1α(3.0435±1.64002 vs.0.9983±0.53323,t=2.905,P=0.027)的mRNA顯著高于OA。2.成功分離RA/OA FLS并行體外培養(yǎng),FLS形態(tài)呈典型的紡錘形或長梭形,旋渦狀生長。q-PCR和WB結(jié)果顯示,RA FLS中FSCN1的mRNA(2.9033±0.10786 vs.1.0000±0.01732,t=30.178,P=0.001)和蛋白(1.8733±0.14189 vs.1.0000±0.11790,t=8.200,P=0.001)水平均顯著高于OAFLS。3.q-PCR、WB和細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)性缺氧下調(diào)RA FLS中HIF-1α的mRNA表達(dá)(1.0000±0.10440 vs.0.2300±0.01000,t=12.716,P=0.006),上調(diào)HIF-1α的蛋白表達(dá)(F=4245.613,P0.001),促進(jìn)HIF-1α蛋白的核轉(zhuǎn)移。4.q-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)性缺氧上調(diào)RA FLS中FSCN1的mRNA(1.0000±0.02646 vs.2.1900±0.02646,t=-55.086,P0.001)和蛋白的表達(dá);q-PCR和WB結(jié)果顯示,HIF-1α的干擾成功,其mRNA(1.0148±0.05677vs.0.4530±0.03010,t=15.143,P0.001)和蛋白(1.0000±0.01339 vs.0.6111±0.01954,t=28.433,P0.001)水平均顯著降低;q-PCR和WB結(jié)果顯示,siHIF-1α下調(diào)實(shí)驗(yàn)性缺氧時RA FLS中的FSCN1的mRNA(1.0012±0.05957 vs.0.5461±0.01764,t=12.688,P0.001)和蛋白(1.0000±0.00000 vs.0.6940±0.01878,t=28.221,P=0.001)水平。5.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)性缺氧(55.6000±6.98570 vs.102.4000±5.68331,t=-11.620,P0.001)促進(jìn)RA FLS的遷移;而HIF-1α的mRNA干擾后,RA FLS的遷移能力明顯降低(102.4000±5.68331 vs.74.8000±7.69415,F=59.170,P0.001)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)性缺氧(138.66667±4.72582 vs.198.6667±6.02771,t=-13.568,P0.001)促進(jìn)RA FLS的侵襲;而HIF-1α的mRNA干擾后,RA FLS的遷移能力明顯降低(190.3333±5.85947vs.148.3333±2.51661,F=142.912,P0.001)。MTT結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)性缺氧可顯著抑制RA FLS的增殖,且其抑制能力與濃度呈正相關(guān)關(guān)系(F=577.700,P0.001)。6.WB顯示實(shí)驗(yàn)性缺氧可顯著上調(diào)RA FLS中FSCN1、HIF-1α的表達(dá)和STAT3的磷酸化。結(jié)論1.FSCN1和HIF-1α在RA滑膜均高表達(dá),且二者存在共定位。2.缺氧條件下,HIF-1α通過上調(diào)FSCN1的表達(dá),促進(jìn)RA FLS的遷移和侵襲。3.STAT3通路可能參與“缺氧調(diào)控RA FLS遷移和侵襲”這一過程的調(diào)控。本研究結(jié)果提示RA滑膜缺氧微環(huán)境可能是FLS遷移和侵襲能力增加的重要原因,而FSCN1和HIF-1α則在其中起著至關(guān)重要的作用,RA FLS中“HIF-1α上調(diào)FSCN1的表達(dá)”可能同時接受STAT3通路的調(diào)控。
【圖文】：

1 Expression of FSCN1 in RA/OA synovium (IHC.1 FSCN1在RA/OA滑膜的表達(dá)（免疫組化，20滑膜高表達(dá)表明，HIF-1α在RA滑膜高表達(dá)，呈彌散強(qiáng)；在OA滑膜表達(dá)呈弱陽性（見圖1.22 Expression of HIF-1α in RA/OA synovium (IHC.2 HIF-1α在RA/OA滑膜的表達(dá)（免疫組化，20

202 Expression of HIF-1α in RA/OA synovium (IHC.2 HIF-1α在RA/OA滑膜的表達(dá)（免疫組化，201α在RA滑膜高表達(dá)，且存在共定位光結(jié)果表明，F(xiàn)SCN1和HIF-1α在RA滑膜定位，，雙陽性區(qū)域表現(xiàn)為黃色，主要集中域（見圖1.5）；而FSCN1和HIF-1α在OA于滑膜細(xì)胞的細(xì)胞漿（見圖1.3），而HI上結(jié)果提示FSCN1和HIF-1α在滑膜局部CN1和HIF-1α之間可能存在某些未知聯(lián)系
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R593.22

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2649997