【摘要】：目的:強直性脊柱炎(Ankyloaing Spondylitis,AS)是一種慢性炎癥性自身免疫疾病,可以累及患者多種組織,導(dǎo)致患者脊柱活動度受限,甚至殘疾。基因研究已經(jīng)證實AS與炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease,IBD)存在風險致病基因重疊現(xiàn)象。越來越多的研究表明G-蛋白偶聯(lián)受體65(G protein coupled-receptor 65,GPR65)與IBD遺傳易感性有關(guān)聯(lián)。本研究旨在探究GPR65基因上兩個標簽單核苷酸多態(tài)性(Tag single nucleotide polymorphisms,tag SNPs)(rs68177277、rs11624293)與中國漢族人群AS疾病易感性的關(guān)聯(lián);同時分析位點基因型分布與AS臨床表型(血沉,C-反應(yīng)蛋白等)之間的關(guān)聯(lián)。方法:采用病例—對照研究設(shè)計,病例來自于安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院風濕免疫科門診,由具有副主任醫(yī)師及以上職稱的風濕科醫(yī)生參照1984年修訂的紐約標準明確診斷為AS,共收集700例強直性脊柱炎患者;按照頻數(shù)匹配的方式,從合肥市血站收集700例年齡、性別匹配的健康個體作為對照納入本次研究。使用Haploview 4.2軟件,從GPR65基因上篩選出兩個tag SNP位點(rs68177277、rs1162429);采用SNPscan技術(shù)對rs68177277和rs11624293位點進行基因分型。采用?~2檢驗比較兩個位點的基因型和等位基因頻率在AS患者與健康對照之間的分布情況,并采用二分類Logistic回歸模型校正年齡、性別,分析兩個位點基因型和等位基因頻率與AS遺傳易感性的關(guān)聯(lián)。同時,構(gòu)建基因位點的顯性遺傳模型,隱性遺傳模型和超顯性遺傳模型,分析兩個位點不同基因型在AS患者和健康對照之間的分布情況�；贏S在不同性別間發(fā)病率存在差異,以性別為分層因素進行分層分析。最后,采用Kruskal-Wallis H檢驗分析位點基因型分布與AS疾病表型(血沉,C-反應(yīng)蛋白,BASDAI,BASFI,指地距和枕墻距)之間的關(guān)聯(lián)。此外,以BASDAI得分將患者劃分為疾病緩解期AS患者和疾病活動期AS患者,并且分別比較不同疾病活動度下位點基因型分布與BASFI和BASDAI得分的關(guān)聯(lián)性。定量資料如果符合正態(tài)分布采用均數(shù)±標準差描述,反之,描述時則采用中位數(shù)(四分位數(shù)間距);定性資料采用頻數(shù)(n,%)描述。所有統(tǒng)計分析均在SPSS 17.0軟件中完成,檢驗水準設(shè)定為雙側(cè)0.05;SNP位點的多重比較使用Bonferroni法進行檢驗水準校正。結(jié)果:在基因分型試驗中,共有40份血樣分型失敗,分型成功率為97.1%,最終分別有673例AS患者和687例健康對照的數(shù)據(jù)納入本次分析。強直性脊柱炎患者和健康對照的平均年齡分別為28.62±7.76歲和28.58±9.31歲;性別比(男/女)分別為548/125和560/127。AS患者的中位病程為3.3(0.8,8.0)年;HLA-B27的陽性率為61.4%;AS患者的BASFI得分為0.90(0.00,2.60),BASDAI得分為2.00(0.60,3.80);按照BASDAI≥4的標準,僅發(fā)現(xiàn)23%的AS患者(152人)處于疾病活動期。遺傳平衡檢驗結(jié)果表明rs68177277和rs1162429位點在對照人群中均符合哈迪-溫伯格平衡(P=0.1822;P=0.9434)�；蚍中徒Y(jié)果顯示:在GPR65基因上的兩個SNPs中,僅rs11624293位點的基因型和等位基因頻率分布在AS患者和健康對照間存在統(tǒng)計學差異(P=0.004;P=0.002),經(jīng)Bonferroni法校正后差異仍具有統(tǒng)計學意義;按性別進行分層分析,結(jié)果顯示:基因型和等位基因頻率分布僅在男性患者和男性健康對照之間具有統(tǒng)計學差異(P=0.013;P=0.010),而在女性患者和女性健康對照之間未觀察到統(tǒng)計學差異(P=0.188;P=0.062)。進一步校正年齡、性別后,Logistic回歸模型分析結(jié)果顯示:攜帶rs11624293-C/T基因型和rs11624293-C等位基因的個體患AS的危險性分別是攜帶rs11624293-T/T基因型和rs11624293-T等位基因個體的1.527倍和1.515倍(OR=1.527,95%CIs:1.190-1.958;OR=1.515,95%CIs:1.183-1.942)。不同遺傳模型分析的結(jié)果表明:rs11624293位點在顯性和超顯性基因模型下的基因型分布在AS患者和健康對照之間的差異均具有統(tǒng)計學差異(顯性模型χ~2=11.169,P=0.001;超顯性模型:χ~2=10.793,P=0.001)。經(jīng)性別分層后,我們觀察到:僅在男性AS患者和男性健康對照之間rs11624293位點的顯性模型(P=0.004)和超顯性模型(P=0.003)分布具有統(tǒng)計學差異,而在女性AS患者和女性健康對照之間未觀察到統(tǒng)計學差異。臨床表型分析結(jié)果顯示AS患者的ESR,CRP,BASDAI,BASFI等臨床指標在rs11624293位點的三個基因型間不具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。此外,以BASDAI得分進行分層分析,結(jié)果顯示:疾病緩解期AS患者的BASFI得分在rs11624293位點的三個基因型間具有統(tǒng)計學差異(P=0.007)。結(jié)論:GPR65基因rs11624293位點的C等位基因以及C/T基因型可能是AS發(fā)病的危險因素,并且該位點對疾病易感性的影響在男性人群中更為顯著。此外,該位點的基因型可能會影響AS患者的疾病嚴重程度。
【圖文】：

基因分型 試驗原理本次研究中基因分型方法采用的是由天昊公司研發(fā)的 SNPscanTM基因簡潔地說，，SNPscan 分型的技術(shù)原理為：首先，采用連接酶連接反應(yīng)找上候選 SNP 位點的等位基因；然后在設(shè)計的探針末段加上由不同數(shù)構(gòu)成的非特異片段，同時通過連接酶加接反應(yīng)，繼而獲得各個位點相片段；以熒光標記的通用引物為基礎(chǔ)對連接產(chǎn)物進行 PCR 擴增，通的 DNA 產(chǎn)物進行分離；最后，根據(jù)電泳圖譜得到候選 SNP 的基因型第一次評估 修改后評估圖 1. GPR65 基因連鎖不平衡圖譜Fig1. Pair-wise LD plot for GPR65 gene variants

20圖 2. SNPscanTMSNP 分型流程圖Fig2. Flow plot of SNPscanTM6.2 主要實驗試劑本次研究中 DNA 提取所用到的試劑主要包括：由上海生化提供溴化乙啶試劑溴酚蘭試劑；Qiagen 公司研制的 Hotstar Taq 試劑盒； NEW ENGLAND 生物科公司銷售的 PCR Marker；SNaPshot Multiplex, 5X Sequencing Buffer, HI-DI,eneScanTM-120 (ABI)；SAP (Promega)；EXOI (Epicentre)等試劑。除此之外，上生化公司為我們提供了引物設(shè)計服務(wù)。6.3 主要試驗儀器DNA 提取中用到的儀器主要包括：DK-8D 型電熱恒溫水槽、電熱恒溫鼓風干
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R593.23

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本文編號：2642906