【摘要】：研究背景:糖尿病作為一種全球性的慢性疾病,嚴(yán)重影響著人們的健康和生活質(zhì)量。糖尿病長(zhǎng)期高血糖可導(dǎo)致各種器官系統(tǒng)損害和嚴(yán)重的并發(fā)癥。其中,糖尿病心臟自主神經(jīng)病變(Diabetic cardiac autonomic neuropathy,DCAN)是其常見(jiàn)的并發(fā)癥,往往被忽視和誤診。它的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,可能是多種因素導(dǎo)致。自主神經(jīng)節(jié)包括交感神經(jīng)節(jié)和副交感神經(jīng)節(jié)。星狀交感神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)纖維可分布至心神經(jīng)叢影響心臟的活動(dòng)。外周交感神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的胞體被周圍的衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞(Satellite glial cells,SGCs)緊密地包圍。SGCs是傷害性信號(hào)傳遞通路中的重要部位,神經(jīng)元-SGCs的異常相互作用涉及外周交感神經(jīng)的病理變化。外界的傷害性刺激可引起神經(jīng)元釋放的三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)增加,ATP作為神經(jīng)遞質(zhì)能夠作用于神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞上嘌呤2(P2)受體,P2受體包含P2X和P2Y受體,已有研究表明P2X受體相關(guān)亞型參與自主神經(jīng)病變過(guò)程。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)頸部交感神經(jīng)節(jié)與糖尿病心臟自主神經(jīng)病變有關(guān),但交感神經(jīng)節(jié)在糖尿病心臟自主神經(jīng)病變中詳細(xì)作用機(jī)理尚不清楚。目的:通過(guò)建立2型糖尿病大鼠模型,探究星狀神經(jīng)節(jié)P2嘌呤受體在2型糖尿病心臟自主神經(jīng)病變中的作用及其機(jī)制。方法:建立2型糖尿病大鼠模型,并隨機(jī)將大鼠分為五組:對(duì)照組(Ctrl)、2型糖尿病模型組(Diabetes Mellitus,DM)、模型合并P2X_3短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)處理組(DM+P2X_3 shRNA)、模型合并P2Y_(12) shRNA處理組(DM+P2Y_(12)2 shRNA)及模型合并空載質(zhì)粒處理組(即模型合并陰性對(duì)照處理組:DM+Negative Control,DM+NC shRNA)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容:(1)各組大鼠心率、血壓、心率變異性變化的檢測(cè);(2)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法檢測(cè)各組大鼠血清中腎上腺素的含量;(3)Real-time PCR和蛋白印跡方法檢測(cè)各組大鼠星狀神經(jīng)節(jié)(SG)中P2Y_(12)受體mRNA和蛋白水平表達(dá)變化;(4)免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)大鼠SG中P2Y_(12)受體與衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物谷氨酰氨合成酶(GS)的共表達(dá);(5)Real-time PCR、蛋白印跡和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)各組大鼠SG中P2X_3受體表達(dá)變化;(6)Real-time PCR和蛋白印跡檢測(cè)炎性因子白介素1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子(TNF-α)的表達(dá)變化;(7)Real-time-PCR和蛋白印跡檢測(cè)縫隙連接蛋白Cx43表達(dá)的變化;(8)電鏡檢測(cè)正常組和2型糖尿病模型大鼠SG中縫隙連接(Gap Junctions,GJs)的變化,了解糖尿病損傷是否導(dǎo)致縫隙連接(GJs)介導(dǎo)的耦聯(lián)增加;(9)蛋白印跡檢測(cè)p38的磷酸化水平。結(jié)果:(1)DM組大鼠的血壓和心率均明顯高于Ctrl組(p0.01),P2X_3shRNA或P2Y_(12)2 shRNA處理七天后大鼠血壓和心率均較DM組明顯降低(p0.01),DM+NC shRNA組大鼠血壓和心率與DM組無(wú)明顯差異(p0.05);心率變異性結(jié)果顯示:DM組大鼠的心率變異性明顯低于Ctrl組(p0.01),P2X_3shRNA或P2Y_(12)2 shRNA處理七天后大鼠心率變異性均較DM組明顯升高(p0.01),DM+NC shRNA組大鼠心率變異性與DM組無(wú)明顯差異(p0.05);(2)ELISA結(jié)果顯示,與Ctrl組相比,DM組血清腎上腺素濃度增加,P2X_3 shRNA或P2Y_(12)2 shRNA處理后血清腎上腺素濃度降低(p0.01),DM+NC sh RNA組血清腎上腺素和DM組之間無(wú)明顯差異(p0.05);(3)Real-time PCR和蛋白印跡方法檢測(cè)各組大鼠星狀神經(jīng)節(jié)中P2Y_(12)受體mRNA和蛋白變化結(jié)果顯示:與Ctrl組相比,DM組大鼠SG中P2Y_(12) mRNA和蛋白水平表達(dá)均明顯高于Ctrl組(p0.05),P2X_3 shRNA或P2Y_(12)2 shRNA處理七天后大鼠SG中P2Y_(12)受體mRNA和蛋白表達(dá)均較DM組明顯降低(p0.05),DM+NC shRNA組與DM組相比無(wú)明顯差異(p0.05);(4)免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果表明SG中P2Y_(12)受體與SGCs標(biāo)志物谷氨酰氨合成酶(GS)共表達(dá),DM和DM+NC shRNA組大鼠P2Y_(12)受體與GS的共表達(dá)熒光強(qiáng)度高于Ctrl組,DM+P2Y_(12)2 shRNA組和DM+P2X_3shRNA組P2Y_(12)受體與GS的共表達(dá)熒光強(qiáng)度低于DM組;(5)Real-time PCR、蛋白印跡和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)各組大鼠SG中P2X_3受體表達(dá)變化結(jié)果顯示星狀神經(jīng)節(jié)P2X_3受體在DM組表達(dá)高于Ctrl組(p0.01),P2X_3 shRNA或P2Y_(12)shRNA處理后大鼠SG中P2X_3受體表達(dá)均降低(p0.01),DM組和DM+NC shRNA組相比無(wú)明顯區(qū)別(p0.05);(6)Real-time PCR和蛋白印跡方法檢測(cè)各組大鼠星狀神經(jīng)節(jié)中炎性因子IL-1β和TNF-α表達(dá)變化,與Ctrl組相比,DM組大鼠SG中IL-1β和TNF-αmRNA和蛋白表達(dá)均明顯高于Ctrl組(p0.01),P2X_3 shRNA或P2Y_(12)2 shRNA處理七天后大鼠SG中IL-1β和TNF-αmRNA和蛋白表達(dá)均較DM組明顯降低(p0.01),DM+NC shRNA組與DM組相比無(wú)明顯差異(p0.05);(7)Real-time PCR和蛋白印跡檢測(cè)縫隙連接蛋白Cx43表達(dá)的變化結(jié)果顯示:與Ctrl組相比,DM組大鼠SG中Cx43 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯高于Ctrl組(p0.05),P2X_3 shRNA或P2Y_(12)2 shRNA處理后大鼠SG中Cx43mRNA和蛋白表達(dá)水平均較DM組明顯降低(p0.01),DM+NC sh RNA組與DM組相比無(wú)明顯差異(p0.05);(8)電鏡結(jié)果顯示,與Ctrl組相比,DM組SGCs間縫隙連接增多,細(xì)胞間耦聯(lián)增強(qiáng);(9)與Ctrl組相比,DM組p38磷酸化水平升高(p0.01),P2X_3 shRNA或P2Y_(12)2 shRNA處理后p38的磷酸化水平均下降(p0.01),DM組和DM+NC shRNA組之間無(wú)明顯差異。結(jié)論:星狀神經(jīng)節(jié)P2受體參與2型糖尿病大鼠心臟自主神經(jīng)病變(DCAN)的病理變化過(guò)程,其機(jī)制可能與神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之間相互作用及p38MAPK信號(hào)通路的激活有關(guān)。P2Y_(12) shRNA和P2X_3 shRNA可緩解2型糖尿病大鼠心臟自主神經(jīng)病變。
【圖文】：

第 3 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果受體的表達(dá) Real-time PCR 和 Western blotting 檢測(cè)各組大鼠星狀神經(jīng)節(jié)中變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與 Ctrl 組相比，DM 組大鼠星狀神經(jīng)明顯升高（p < 0.01）；與 DM 組相比，DM+P2Y12shRNA 組、D組 P2Y12受體表達(dá)明顯降低（p < 0.05）；DM 組與DM+NC shRNA無(wú)明顯差異(p > 0.05)（見(jiàn)圖 1）。鼠星狀神經(jīng)節(jié)P2Y12受體表達(dá)的變化eal-time PCR 和 Western blotti ng 檢測(cè)各組大鼠星狀神

表明 P2Y12受體表達(dá)在星狀神經(jīng)節(jié)衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞。（見(jiàn)圖2）。3.3 大鼠星狀神經(jīng)節(jié)P2Y12受體表達(dá)的變化3.3.1 Real-time PCR 和 Western blotti ng 檢測(cè)各組大鼠星狀神經(jīng)節(jié)中
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R587.2

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本文編號(hào)：2640185