【摘要】：背景:甲狀旁腺素(Parathyoid Hormone,PTH)是正常人體內(nèi)的鈣調(diào)節(jié)激素,N端34個氨基酸多肽(PTH(1-34),特立帕肽)是臨床上治療骨質(zhì)疏松的促骨形成藥物,但僅限于間斷使用。這是由于其兼具破骨作用,因此在體內(nèi)連續(xù)應(yīng)用會顯著促進骨吸收;近年來的研究都主要著重于提高其成骨作用、避免破骨作用,但進展甚微。PTH能夠與甲狀旁腺素Ⅰ型受體結(jié)合,激活蛋白激酶C(PKC)通路,從而改善和提高松質(zhì)骨骨量,并且它還能夠改善骨小梁的微觀結(jié)構(gòu)。在我們前期實驗中,我們已經(jīng)驗證并合成了能夠特異性激活PKC通路的PTH模擬肽(MY-1),通過對其進行離體和在體實驗,我們發(fā)現(xiàn)MY-1肽具有促進成骨細胞分化,但不激活破骨細胞分化和增殖的作用。體內(nèi)實驗研究發(fā)現(xiàn),MY-1肽擁有與PTH(1-34)相近的改善或延緩去勢后造成的骨量丟失的作用。PTH肽連續(xù)作用對骨代謝的影響是研究它破骨效應(yīng)研究的重要方式。目的:通過我們前期合成的特異性激活PKC通路的PTH模擬肽進行體內(nèi)和體外實驗,探討適于PTH持續(xù)灌注對骨骼系統(tǒng)的作用研究合適的動物模型,評價MY-1肽連續(xù)應(yīng)用時的骨質(zhì)變化。方法:取5只8周齡小鼠(C57BL/6J)提取股骨和脛骨的骨髓基質(zhì)細胞(BMSC)、骨髓源巨噬細胞(BMMs);成骨誘導(dǎo)BMSC細胞,對細胞采用茜素紅染色、鈣定量分析、堿性磷酸酶染色及堿性磷酸酶活性測定,破骨誘導(dǎo)BMMs,對細胞進行TRAP染色及抗酒石酸酸性磷酸酶活性測定;提取3日齡左右乳鼠(C57BL/6J)的顱骨原代成骨細胞,通過RT-PCR測定特異性成骨基因表達水平。取24只6周齡C57BL/6J雌性小鼠,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,隨機取12只小鼠行卵巢切除術(shù),術(shù)后觀察一周,對OVX-TPTD組和TPTD組植入ALZET2004型微量緩釋泵模擬連續(xù)使用TPTD。在第2周末行頸椎脫臼法處死后常溫固定,取其脛骨進行MicroCT掃描,對松質(zhì)骨進行定量分析,取脛骨做石蠟切片,進行HE及TRAP染色,觀察骨小梁和破骨細胞分布情況,觀察脛骨生長板厚度。取18只7周齡C57BL/6J雌性小鼠,通過對處理組植入ALZET2004型微量緩釋泵模擬連續(xù)使用PTH(1-34)和MY-1肽。在第2周末行頸椎脫臼法處死后常溫固定,取其脛骨進行MicroCT掃描,對松質(zhì)骨進行定量分析,取脛骨做石蠟切片,進行HE及TRAP染色,觀察骨小梁和破骨細胞分布情況,觀察脛骨生長板厚度。結(jié)果:(1)脛骨松質(zhì)骨骨量的測定,骨小梁體積分數(shù)PTH(1-34)組低于SHAM組,但MY-1組骨小梁體積分數(shù)與SHAM組略高于SHAM組,且明顯高于PTH(1-34)組。OVX組顯著低于SHAM組,PTH+OVX組顯著高于OVX組。脛骨上段病理切片顯示:骨小梁所占面積百分數(shù),PTH(1-34)組、MY-1組與SHAM組顯著性差異,OVX組顯著低于SHAM組,PTH+OVX組顯著高于OVX組。脛骨上段骨小梁發(fā)生區(qū)的厚度PTH(1-34)組和OVX組明顯低于SHAM組,MY-1組與SHAM組無統(tǒng)計學(xué)差異,PTH+OVX組明顯高于OVX組。(3)BMSC成骨誘導(dǎo)結(jié)果:茜素紅染色示,PTH(1-34)組較對照組紅色結(jié)節(jié)面積較少MY-1組紅色結(jié)節(jié)面積明顯高于對照組;堿性磷酸酶染色示,CON組、PTH(1-34)組、MY-1組均出現(xiàn)深藍色染色,且PTH(1-34)組和MY-1組染色明顯較對照組深,ALP定量檢測示,酶活性在PTH(1-34)組出現(xiàn)降低、MY-1組的酶活性顯著提升,PTH(1-34)vsMY-1;(4)BMMs破骨誘導(dǎo)結(jié)果:TRAP染色提示PTH(1-34)組和MY-1組TRAP陽性細胞數(shù)目明顯增高,且均較CON組更多,但MY-1組破骨細胞增多數(shù)目較少;抗酒石酸酸性磷酸酶定量測定顯示PTH(1-34)組和MY-1組的酶活性與CON組相比均有升高,但PTH(1-34)組TRAP酶活性高于MY-1組,兩組間有統(tǒng)計學(xué)差異。(5)顱骨原代和BMSC細胞RT-PCR結(jié)果:成骨相關(guān)特異性基因(ALP、BSP、OC、OPG)表達,PTH(1-34)組相比對照組明顯抑制,MY-1組相對于對照組明顯上調(diào)。PTH(1-34)組相對于對照組,Rankl基因表達明顯上調(diào),MY-1組與對照組相比則表現(xiàn)出抑制。結(jié)論:細胞和動物實驗綜合顯示,MY-1肽具有比PTH更好的促進成骨分化的作用,并且未表現(xiàn)出和PTH 一樣的促進破骨分化的作用。由于MY-1肽在PKC通路的特異性,提示PKC信號通路可能特異性促進成骨分化。MY-1肽具有局部應(yīng)用的可能。在研究甲狀旁腺素連續(xù)應(yīng)用的過程中,我們發(fā)現(xiàn)去卵巢小鼠和正常小鼠顯現(xiàn)的效果不一致,雌激素對PTH連續(xù)應(yīng)用的影響、機理和臨床效應(yīng)需要深入研究,但提示我們在實驗動物模型的選擇和研究結(jié)果解讀需要更加慎重。
【圖文】：

圖１－ｌＢＭＳＣｓ成骨誘導(dǎo)分化以及ＢＭＭｓ的破骨誘導(dǎo)分化Ａ：邋ＢＭＳＣ和ＢＭＭｓ接種于被Ｉ型逡逑膠原包被的２４孔板中，采用４８小時為一周期，持續(xù)藥物刺激的給藥模式。１４天連續(xù)成骨逡逑誘導(dǎo)后進行ＡＬＰ染色；對連續(xù)成骨誘導(dǎo)２８天后的ＢＭＳＣ細胞，進行茜素紅染色；對ＢＭＭｓ逡逑進行破骨誘導(dǎo)７天后進行ＴＲＡＰ染色（掃描儀圖像）。Ｂ：邋ＢＭＳＣ成骨誘導(dǎo)１４天后的ＡＬＰ逡逑定量檢測（＊邋Ｐ＜０．０５邋ｖｓＣｏｎｔｒｏｌ，＃Ｐ＜０．０５邋ｖｓＰＴＨ）邋；Ｃ：ＢＭＳＣ成骨誘導(dǎo)２８天后鈣離子濃度逡逑定量檢測（＊邋Ｐ＜0．0５邋ｖｓＣｏｎｔｒｏ〖，＃Ｐ＜０．０５邋ｖｓＰＴＨ）邋；邋Ｄ：連續(xù)破骨誘導(dǎo)７天后的ＢＭＭｓ的逡逑ＴＲＡＰ酶定量檢測（＊邋Ｐ＜０．０５邋ｖｓ邋Ｃｏｎｔｒｏｌ，邋＃邋Ｐ＜０．０５邋ｖｓ邋ＰＴＨ）逡逑Ｆｉｇ．１－１邋Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ邋Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＢＭＳＣｓ邋ａｎｄ邋Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ－Ｉｎｄｕｃｅｄ邋Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＢＭＭｓ逡逑Ａ：邋ＢＭＳＣｓ邋ａｎｄ邋ＢＭＭｓ邋ｗｅｒｅ邋ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ邋ｉｎｔｏ邋ａ邋２４－ｗｅｌｌ邋ｐｌａｔｅ邋ｃｏａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｔｙｐｅ邋Ｉ邋ｃｏｌｌａｇｅｎ邋ｕｓｉｎｇ邋ａ逡逑４８－ｈｏｕｒ邋ｃｙｃｌｅ邋ｔｏ邋ｍａｉｎｔａｉｎ邋ａ邋ｄｒｕｇ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ邋ｍｏｄｅ邋ｏｆ邋ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．邋ＡＬＰ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｗａｓ邋ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ逡逑ａｆｔｅｒ邋１４邋ｄａｙｓ邋ｏｆ邋ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ邋ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ邋ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；邋ＢＭＳＣ邋ｃｅｌｌｓ邋ａｆｔｅｒ邋２８邋ｄａｙｓ邋ｏｆ邋ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ逡逑２２逡逑

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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R580

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本文編號：2635692