【摘要】：研究目的骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSC)具有分化成許多種組織細胞的潛在能力,如可以分化為成骨細胞(osteoblast)、破骨細胞(osteoclast)、軟骨細胞(chondrocyte)和脂肪細胞(adipocyte)等多種細胞。在正常條件下,BMSC分化成各種細胞的傾向和能力是相同的,即保持著動態(tài)平衡。在年齡、激素、藥物和遺傳等因素作用下,這個平衡被打破,BMSC分化為成骨細胞的能力降低,而分化為脂肪細胞的的能力增強,就容易導致包括骨質(zhì)疏松在內(nèi)的多種骨代謝疾病。骨質(zhì)疏松癥的特點骨形成減少和骨髓脂肪堆積增加。然而,目前對BMSC分化成骨細胞和脂肪細胞的分子調(diào)控機制仍不清楚,對骨質(zhì)疏松癥的預防和治療仍有待深入研究。生物磁性材料在醫(yī)學方面有比較廣泛應用,如磁性納米載體、醫(yī)用造影劑、示蹤劑和牙科蓋髓劑等,這些磁性材料通常能產(chǎn)生穩(wěn)態(tài)磁場,并通量泄漏擴散到鄰近組織發(fā)揮生物學效應。據(jù)報道穩(wěn)態(tài)磁場可以驅(qū)動納米鐵修飾的干細胞的定向遷移,也可以增加牙髓干細胞的存活和增值、促進向牙骨細胞分化等。然而,穩(wěn)態(tài)磁場對BMSC的分化及骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展的作用及相關(guān)分子機制仍不明確。細胞或生物體對磁場的感應現(xiàn)象普遍存在,其中一個焦點是細胞或生物體內(nèi)接受磁場感應的分子是否存在。在生物系統(tǒng)里面有三類磁感應材料或分子,它們是亞鐵礦物質(zhì)、鐵結(jié)合蛋白和鐵硫簇蛋白,根據(jù)鐵硫簇蛋白在生命活動中所起的重要作用,科學家們推測它們可能會是感受或接受磁場信號的靶分子。然而,目前有關(guān)磁蛋白的研究還存在很大局限,需要我們作進一步的探索和證實。該研究擬以探索穩(wěn)態(tài)磁場對BMSC的分化和骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展的作用為研究目的,致力于深入闡明穩(wěn)態(tài)磁場影響B(tài)MSC分化和骨質(zhì)疏松癥的機制,尤其是找到磁感應蛋白分子,為臨床預防和治療骨質(zhì)疏松提供可能的新的思路和策略。研究方法我們首先分離并鑒定了小鼠的BMSC,然后分別進行脂肪誘導分化和成骨誘導分化,在這個過程不給于磁場或分別給予梯度強度的穩(wěn)態(tài)磁場處理,誘導完成后利用油紅O染色、ALP活性檢測或茜素紅染色、轉(zhuǎn)錄組測序、RT-PCR和蛋白印跡等實驗分析檢測穩(wěn)態(tài)磁場對BMSC成脂分化和成骨分化的影響;在動物水平上,我們采用反式維甲酸(ATRA)和地塞米松(Dex)兩種藥物誘導的小鼠骨質(zhì)疏松癥模型,通過穩(wěn)態(tài)磁場進行干預,然后檢測分析穩(wěn)態(tài)磁場對小鼠骨質(zhì)疏松癥的作用。進一步,我們通過基因表達譜分析、藥物干預和遺傳學手段去探究穩(wěn)態(tài)磁場影響B(tài)MSC分化和小鼠骨質(zhì)疏松癥的分子機制。研究結(jié)果1.穩(wěn)態(tài)磁場對BMSC的成脂分化具有抑制作用。利用油紅O染色、轉(zhuǎn)錄組測序、RT-PCR和蛋白印跡等實驗分析檢測了穩(wěn)態(tài)磁場處理條件下BMSC成脂分化情況,發(fā)現(xiàn)穩(wěn)態(tài)磁場抑制BMSC成脂分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達從而抑制BMSC向脂肪分化,并且具有一定的磁場強度劑量依賴性;2.磁場對BMSC的成骨分化具有促進作用。利用ALP活性檢測、茜素紅染色、轉(zhuǎn)錄組測序、RT-PCR和蛋白印跡等實驗檢測分析了穩(wěn)態(tài)磁場刺激條件下BMSC的成骨分化情況,結(jié)果表明穩(wěn)態(tài)磁場能促進BMSC成骨分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達從而增強BMSC向成骨細胞分化,高劑量磁場的效果更為明顯;3.穩(wěn)態(tài)磁場可以改善骨質(zhì)疏松癥。穩(wěn)態(tài)磁場可以明顯改善ATRA和Dex誘導的小鼠骨質(zhì)疏松的惡化情況,同時骨組織的脂肪堆積減少,而成骨細胞的活性增加,這說明穩(wěn)態(tài)磁場可以通過抑制脂肪累積促進成骨分化而阻遏骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展;4.Abce1在BMSC的分化過程中發(fā)揮作用,并且穩(wěn)態(tài)磁場通過抑制RNase L inhibitor的功能抑制BMSC的成脂分化,Abce1的缺失使穩(wěn)態(tài)磁場對骨質(zhì)疏松癥的作用被抵消。說明Abce1可能是一個磁感應蛋白分子,并介導穩(wěn)態(tài)磁場在BMSC分化和骨質(zhì)疏松癥過程中的作用。研究結(jié)論在這里我們報道了穩(wěn)態(tài)磁場能夠影響B(tài)MSC的分化從而影響骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展。我們通過大量的實驗證明了穩(wěn)態(tài)磁場能有效抑制BMSC的成脂分化,而促進BMSC的成骨分化。另外,我們通過兩個骨質(zhì)疏松癥動物模型證實了穩(wěn)態(tài)磁場減少骨質(zhì)疏松模型小鼠的骨組織流失,并且減少脂肪堆積,促進成骨細胞的活性。此外,我們還發(fā)現(xiàn)Fe-S簇蛋白Abce1在BMSC的分化過程中發(fā)揮作用,并且穩(wěn)態(tài)磁場通過抑制RNase L inhibitor的功能抑制BMSC的成脂分化,Abce1的缺失使穩(wěn)態(tài)磁場對骨質(zhì)疏松癥的作用被抵消,這說明Abce1可能就是一個磁感應蛋白,在穩(wěn)態(tài)磁場影響B(tài)MSC分化和骨質(zhì)疏松癥發(fā)展過程中發(fā)揮重要介導作用。根據(jù)這些研究結(jié)果和證據(jù),我們揭示了穩(wěn)態(tài)磁場對骨質(zhì)疏松癥的作用效果和機制,穩(wěn)態(tài)磁場可能作為一種有效的預防和治療骨質(zhì)疏松的輔助手段,而Abce1可能作為其中一個分子靶標。
【圖文】：

天津醫(yī)科大學博士學位論文分化為成熟脂肪細胞就會累積形成脂滴，累積的脂滴可被油紅著色。在誘導 7-14天后，我們對對照組和實驗組的分化細胞分別做了油紅 O 染色，結(jié)果顯示 SMF處理組油紅 O 染色較淺（圖 1.1 C），其洗滌液的 OD 值也降低（圖 1.1 D）。綜上，，我們可以看到穩(wěn)態(tài)磁場（SMF）對 BMSC 的成脂分化具有抑制作用，并且這種抑制作用具有 定的劑量依賴性。

天津醫(yī)科大學博士學位論文1.2.2 穩(wěn)態(tài)磁場影響間充質(zhì)干細胞成脂分化的轉(zhuǎn)錄組分析在上述的定性實驗中，我們看到了穩(wěn)態(tài)磁場似乎對 BMSC 成脂分化具有抑制效應，并且在某種程度上呈 定的劑量依賴性。鑒于干細胞的分化主要涉及相關(guān)基因的開啟、轉(zhuǎn)錄和表達，我們對 SMF 處理和不處理的 BMSC 成脂誘導分化后進行了轉(zhuǎn)錄組的表達分析（RNA-sequence）（在這里我們選用的是最高 0.6T的磁場進行處理）以進 步確定 SMF 對 BMSC 成脂分化的作用。經(jīng)過分析，我們發(fā)現(xiàn)與對照組相比，成脂分化相關(guān)基因在 SMF 的干預下表達呈降低趨勢（如圖 1.2A）。此外，聚類分析發(fā)現(xiàn)，成脂分化和能量轉(zhuǎn)化相關(guān)生物過程被抑制（如圖1.2 B）。以上結(jié)果進 步肯定了我們的觀點，即SMF對間充質(zhì)干細胞（BMSC）成脂肪分化過程呈阻遏效應。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R580

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本文編號：2631941