【摘要】：研究目的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSC)具有分化成許多種組織細(xì)胞的潛在能力,如可以分化為成骨細(xì)胞(osteoblast)、破骨細(xì)胞(osteoclast)、軟骨細(xì)胞(chondrocyte)和脂肪細(xì)胞(adipocyte)等多種細(xì)胞。在正常條件下,BMSC分化成各種細(xì)胞的傾向和能力是相同的,即保持著動(dòng)態(tài)平衡。在年齡、激素、藥物和遺傳等因素作用下,這個(gè)平衡被打破,BMSC分化為成骨細(xì)胞的能力降低,而分化為脂肪細(xì)胞的的能力增強(qiáng),就容易導(dǎo)致包括骨質(zhì)疏松在內(nèi)的多種骨代謝疾病。骨質(zhì)疏松癥的特點(diǎn)骨形成減少和骨髓脂肪堆積增加。然而,目前對(duì)BMSC分化成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的分子調(diào)控機(jī)制仍不清楚,對(duì)骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療仍有待深入研究。生物磁性材料在醫(yī)學(xué)方面有比較廣泛應(yīng)用,如磁性納米載體、醫(yī)用造影劑、示蹤劑和牙科蓋髓劑等,這些磁性材料通常能產(chǎn)生穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng),并通量泄漏擴(kuò)散到鄰近組織發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。據(jù)報(bào)道穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng)可以驅(qū)動(dòng)納米鐵修飾的干細(xì)胞的定向遷移,也可以增加牙髓干細(xì)胞的存活和增值、促進(jìn)向牙骨細(xì)胞分化等。然而,穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng)對(duì)BMSC的分化及骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展的作用及相關(guān)分子機(jī)制仍不明確。細(xì)胞或生物體對(duì)磁場(chǎng)的感應(yīng)現(xiàn)象普遍存在,其中一個(gè)焦點(diǎn)是細(xì)胞或生物體內(nèi)接受磁場(chǎng)感應(yīng)的分子是否存在。在生物系統(tǒng)里面有三類磁感應(yīng)材料或分子,它們是亞鐵礦物質(zhì)、鐵結(jié)合蛋白和鐵硫簇蛋白,根據(jù)鐵硫簇蛋白在生命活動(dòng)中所起的重要作用,科學(xué)家們推測(cè)它們可能會(huì)是感受或接受磁場(chǎng)信號(hào)的靶分子。然而,目前有關(guān)磁蛋白的研究還存在很大局限,需要我們作進(jìn)一步的探索和證實(shí)。該研究擬以探索穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng)對(duì)BMSC的分化和骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展的作用為研究目的,致力于深入闡明穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng)影響B(tài)MSC分化和骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制,尤其是找到磁感應(yīng)蛋白分子,為臨床預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松提供可能的新的思路和策略。研究方法我們首先分離并鑒定了小鼠的BMSC,然后分別進(jìn)行脂肪誘導(dǎo)分化和成骨誘導(dǎo)分化,在這個(gè)過程不給于磁場(chǎng)或分別給予梯度強(qiáng)度的穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng)處理,誘導(dǎo)完成后利用油紅O染色、ALP活性檢測(cè)或茜素紅染色、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、RT-PCR和蛋白印跡等實(shí)驗(yàn)分析檢測(cè)穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng)對(duì)BMSC成脂分化和成骨分化的影響;在動(dòng)物水平上,我們采用反式維甲酸(ATRA)和地塞米松(Dex)兩種藥物誘導(dǎo)的小鼠骨質(zhì)疏松癥模型,通過穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng)進(jìn)行干預(yù),然后檢測(cè)分析穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng)對(duì)小鼠骨質(zhì)疏松癥的作用。進(jìn)一步,我們通過基因表達(dá)譜分析、藥物干預(yù)和遺傳學(xué)手段去探究穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng)影響B(tài)MSC分化和小鼠骨質(zhì)疏松癥的分子機(jī)制。研究結(jié)果1.穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng)對(duì)BMSC的成脂分化具有抑制作用。利用油紅O染色、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、RT-PCR和蛋白印跡等實(shí)驗(yàn)分析檢測(cè)了穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng)處理?xiàng)l件下BMSC成脂分化情況,發(fā)現(xiàn)穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng)抑制BMSC成脂分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)從而抑制BMSC向脂肪分化,并且具有一定的磁場(chǎng)強(qiáng)度劑量依賴性;2.磁場(chǎng)對(duì)BMSC的成骨分化具有促進(jìn)作用。利用ALP活性檢測(cè)、茜素紅染色、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、RT-PCR和蛋白印跡等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分析了穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng)刺激條件下BMSC的成骨分化情況,結(jié)果表明穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng)能促進(jìn)BMSC成骨分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)從而增強(qiáng)BMSC向成骨細(xì)胞分化,高劑量磁場(chǎng)的效果更為明顯;3.穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng)可以改善骨質(zhì)疏松癥。穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng)可以明顯改善ATRA和Dex誘導(dǎo)的小鼠骨質(zhì)疏松的惡化情況,同時(shí)骨組織的脂肪堆積減少,而成骨細(xì)胞的活性增加,這說明穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng)可以通過抑制脂肪累積促進(jìn)成骨分化而阻遏骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展;4.Abce1在BMSC的分化過程中發(fā)揮作用,并且穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng)通過抑制RNase L inhibitor的功能抑制BMSC的成脂分化,Abce1的缺失使穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng)對(duì)骨質(zhì)疏松癥的作用被抵消。說明Abce1可能是一個(gè)磁感應(yīng)蛋白分子,并介導(dǎo)穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng)在BMSC分化和骨質(zhì)疏松癥過程中的作用。研究結(jié)論在這里我們報(bào)道了穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng)能夠影響B(tài)MSC的分化從而影響骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展。我們通過大量的實(shí)驗(yàn)證明了穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng)能有效抑制BMSC的成脂分化,而促進(jìn)BMSC的成骨分化。另外,我們通過兩個(gè)骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型證實(shí)了穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng)減少骨質(zhì)疏松模型小鼠的骨組織流失,并且減少脂肪堆積,促進(jìn)成骨細(xì)胞的活性。此外,我們還發(fā)現(xiàn)Fe-S簇蛋白Abce1在BMSC的分化過程中發(fā)揮作用,并且穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng)通過抑制RNase L inhibitor的功能抑制BMSC的成脂分化,Abce1的缺失使穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng)對(duì)骨質(zhì)疏松癥的作用被抵消,這說明Abce1可能就是一個(gè)磁感應(yīng)蛋白,在穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng)影響B(tài)MSC分化和骨質(zhì)疏松癥發(fā)展過程中發(fā)揮重要介導(dǎo)作用。根據(jù)這些研究結(jié)果和證據(jù),我們揭示了穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng)對(duì)骨質(zhì)疏松癥的作用效果和機(jī)制,穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng)可能作為一種有效的預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的輔助手段,而Abce1可能作為其中一個(gè)分子靶標(biāo)。
【圖文】：

天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文分化為成熟脂肪細(xì)胞就會(huì)累積形成脂滴，累積的脂滴可被油紅著色。在誘導(dǎo) 7-14天后，我們對(duì)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的分化細(xì)胞分別做了油紅 O 染色，結(jié)果顯示 SMF處理組油紅 O 染色較淺（圖 1.1 C），其洗滌液的 OD 值也降低（圖 1.1 D）。綜上，，我們可以看到穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng)（SMF）對(duì) BMSC 的成脂分化具有抑制作用，并且這種抑制作用具有 定的劑量依賴性。

天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文1.2.2 穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng)影響間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的轉(zhuǎn)錄組分析在上述的定性實(shí)驗(yàn)中，我們看到了穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng)似乎對(duì) BMSC 成脂分化具有抑制效應(yīng)，并且在某種程度上呈 定的劑量依賴性。鑒于干細(xì)胞的分化主要涉及相關(guān)基因的開啟、轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，我們對(duì) SMF 處理和不處理的 BMSC 成脂誘導(dǎo)分化后進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)分析（RNA-sequence）（在這里我們選用的是最高 0.6T的磁場(chǎng)進(jìn)行處理）以進(jìn) 步確定 SMF 對(duì) BMSC 成脂分化的作用。經(jīng)過分析，我們發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，成脂分化相關(guān)基因在 SMF 的干預(yù)下表達(dá)呈降低趨勢(shì)（如圖 1.2A）。此外，聚類分析發(fā)現(xiàn)，成脂分化和能量轉(zhuǎn)化相關(guān)生物過程被抑制（如圖1.2 B）。以上結(jié)果進(jìn) 步肯定了我們的觀點(diǎn)，即SMF對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）成脂肪分化過程呈阻遏效應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R580

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本文編號(hào)：2631941