【摘要】：目的:聚合酶δ相互作用蛋白2(Polymerase delta-interacting protein 2,Poldip2)是在人體中由Poldip2基因編碼的酶。它能增加NADPH氧化酶4(NADPH oxidase4,NOX4)的活性。我們認為在KKAy小鼠中Poldip2的增加可以促進過氧化物(Hydrogen Peroxide,H_2 O_2)的產(chǎn)生,改變胰島素信號通路,尤其是肝臟中的糖代謝和脂代謝,從而改善糖脂水平。本研究的目的是探討Poldip2在改善血糖水平和抑制KKAy小鼠肝臟糖異生具有潛在的益處。方法:利用特殊的糖尿病模型鼠即KKAy小鼠,將其隨機分為磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline,PBS)組,綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)組和尾靜脈注入聚合酶δ相互作用蛋白2(Poldip2)組。C57BL/6J小鼠作為正常對照組。利用Western blot方法探究KKAy小鼠體內Poldip2的蛋白變化情況以及胰島素信號通路中下游蛋白如蛋白激酶B(Protein kinase,Akt),Forkhead轉錄因子1(Forkhead box protein O1,FoxO1)及其磷酸化等蛋白表達水平與正常小鼠的差異,以及下游糖異生蛋白調控基因磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK),葡萄糖-6-磷酸酶(Glucose6-phosphatase,G6Pase)表達的變化,并且用RT-PCR再次從RNA水平進一步驗證糖異生的關鍵酶PEPCK,G6Pase的mRNA相對表達水平的變化,同時采用生化試劑盒檢測糖尿病小鼠的生化指標,了解其與正常對照組之間存在的差異。結果:(1)與正常對照組C57 BL/6 J小鼠相比,KKAy模型鼠體質量增加明顯,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),KKAy小鼠的空腹血糖水平相較于正常對照組C57BL/6J小鼠明顯升高,差異是有統(tǒng)計學意義的(P0.05)。經(jīng)過干預處理及隨機分組后,四組干預1周后體質量均未見明顯變化。但Poldip2組干預后空腹血糖水平較干預前得到明顯改善(P0.05).四組之間的過氧化物(Hydrogen Peroxide,H_2 O_2)水平差異有統(tǒng)計學意義(F=95.17,P0.05)。與正常對照組C57BL/6J組相比,PBS組和GFP組過氧化氫的水平顯著降低(P0.05),而Poldip2組則無明顯變化。與正常對照組C57BL/6J小鼠的胰島素水平相比,PBS組和GFP組的胰島素水平明顯升高(P0.001)。與GFP組和PBS組小鼠相比,Poldip2組的胰島素水平明顯下降(P0.001)。(2)與正常對照組C57 BL/6 J相比,PBS組和GFP組Poldip2的蛋白表達被顯著抑制(P0.05),而與PBS組和GFP組相比,Poldip2組的Poldip2表達水平明顯上升(P0.05)。與正常對照組C57 BL/6 J小鼠相比,PBS組和GFP組的Catalase蛋白表達水平明顯下降(P0.05),但Poldip2組Catalase蛋白活性與正常對照組相比無明顯變化。與正常對照組C57 BL/6 J小鼠相比,PBS組和GFP組的磷酸化10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源(phospho-Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)與PTEN的比值顯著降低(P0.05),PTEN明顯上升(P0.05)。與PBS組、GFP組相比,Poldip2組中p-PTEN與PTEN的比值升高至正常水平。(3)與正常對照組C57 BL/6 J小鼠相比,PBS組和GFP組的Rictor活性明顯下降(P0.05),而Poldip2組的則無明顯的變化。與正常對照組C57 BL/6 J小鼠相比,其余3組中總Akt蛋白表達水平無明顯變化,但PBS組和GFP組中Akt的絲氨酸473位點磷酸化(p-Akt473)和Akt的蘇氨酸308位點磷酸化(p-Akt308)的表達顯著降低(P0.05),Poldip2組的p-Akt473和p-Akt308則上升至正常水平。PBS組和GFP組的p-FoxO1與FoxO1的比值顯著低于對照組C57 BL/6 J小鼠(P0.05),但Poldip2組的比值則無明顯變化。(4)與正常對照組C57 BL/6 J小鼠相比,PBS組和GFP組中的PEPCK和G6Pase表達水平明顯升高(P0.05)。而與PBS組、GFP組相比,Poldip2組中的PEPCK和G6Pase顯著降低(P0.05)。(5)通過RT-PCR中可以了解這四組肝臟中PEPCK和G6Pase的mRNA表達。與正常對照組C57 BL/6 J組相比,PBS組和GFP組PEPCK和G6Pase mRNA表達水平顯著升高(P0.05),但Poldip2組的mRNA表達水平卻無明顯變化。與PBS組和GFP組相比,Poldip2組的PEPCK和G6Pase mRNA表達水平明顯降低(P0.05)。RT-PCR的結果與Western blot相一致。結論:1.Poldip2對于2型糖尿病肝臟的胰島素抵抗有改善作用,并在血糖代謝調節(jié)中可能起到一定的作用。2.Poldip2能夠改善小鼠的糖代謝,機制可能是通過升高Poldip2的表達,激活NOX4從而產(chǎn)生H2O2,過度氧化抑制了PTEN的活性,進而激活Akt的活性,改善了胰島素信號通路及糖代謝的紊亂。
【圖文】：

組 C57BL/6J 小鼠的體質量（28.91±0.72）g 相比， KKAy 小鼠體質量增加明顯，兩者之間的差異是有統(tǒng)計學意義的（ P<0.05）； 空腹血糖水平 KKAy 小鼠的為（9.57±0.47）mmol/ L 相較于正常對照組 C57BL/6J 小鼠的空腹血糖（6.41±0.20）mmol/ L 相比明顯升高， 差異具有統(tǒng)計學意義（ P<0.05）。 之后根據(jù)處理不同分為 4 組進行干預 1 周。而對于各組，干預 1 周后體質量均未見明顯變化。干預前空腹血糖水平 Poldip2 組為（9.78±0.29）mmol/L，，在干預后的 Poldip2 組空腹血糖水平為：（8.64±0.28）mmol/L，兩者差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明 Poldip2可能具有降低 KKAy 的血糖水平的作用。3.2 肝臟 H2O2的檢測從小鼠新鮮肝臟中測 H2O2水平，四組之間的 H2O2水平差異有統(tǒng)計學意義（F=95.17，P<0.05)。與正常對照組 C57BL/6J 組相比，PBS 組和 GFP 組的水平顯著降低（P<0.05），而 Poidip2 組則無明顯變化。見圖 1。

24圖 2.通過 Western blot 分析 C57BL/6J 正常對照組和 KKAy 小鼠的蛋白Poldip2，Catalase， PTEN 及 p- PTEN 的蛋白表達水平，并以 β- actin 為內參照。Fig2. The protein expressions of Poldip2，Catalase，PTEN and p-PTEN in C57BL/6 Jwhich is normal control group and KKAy mice were analyzed by Western blot，and β-actin was used as internal reference.注：1 代表正常對照組，2 代表 KKAy 中的 PBS 組，3 代表 KKAy 中的 GFP 組，4 代表 KKAy中的 Poldip2 組。 * 與正常對照組比較，P<0.05。Note：1 as normal control group，2 as PBS group in the KKAy mice,3 as GFP group in the KKAymice，3 as Poldip2 group in the KKAy mice.* as compared with normal control group， P<0.05.3.4.2 肝臟組織中 Akt、Rictor、FoxO1 及 p-FoxO1 的表達
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R587.1

【參考文獻】

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本文編號：2620898