【摘要】：糖尿病患者數(shù)量在過去幾十年間迅速增加,中國人群的患病率約為11.6%,其中2型糖尿病占90%,2015年糖尿病成為了第六大主要致殘因素。2型糖尿病主要特點是胰島β細胞功能障礙和胰島素抵抗所導致的胰島素相對不足。盡管越來越多的2型糖尿病風險因素和改善其發(fā)展進程的機理被人們所揭示,但2型糖尿病的發(fā)病率仍在不斷增長。人體腸道微生物與宿主之間在長期的共進化過程中形成了一種互利共生的關系,宿主長期的飲食習慣以及生理上的特征對于腸道菌群的種類和豐度都會造成很大的影響,另一方面,腸道菌群的生理活動同時又會影響宿主的健康狀態(tài)。人體腸道微生物對于人體有益的功能主要在營養(yǎng)代謝和免疫防御等方面。近年來多項研究顯示腸道菌群紊亂與超過五十種疾病有關,包括糖尿病、動脈粥樣硬化、肝硬化、抑郁癥和心衰等。隨著對腸道微生物的不斷深入研究,腸道菌群在2型糖尿病發(fā)生發(fā)展以及治療中的作用顯得越來越重要。研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病的發(fā)生伴隨著短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌的減少和機會致病菌的增加。另有研究使用中藥復方葛根芩連湯治療2型糖尿病患者后發(fā)現(xiàn),2型糖尿病患者的腸道菌群有顯著變化,且菌群的改變早于癥狀的改善,這一結果提示葛根芩連湯治療2型糖尿病可能是通過改變腸道菌群來發(fā)揮作用的。雖然2型糖尿病與腸道微生物的相關性已經(jīng)被廣泛報道,但目前的研究依舊停留在對腸道微生物結構和豐度的研究,尚未深入到菌株基因?qū)用?更沒有對菌株基因功能差異帶來的蛋白的功能不同做研究。另外,目前也沒有直接從糞便基因組中擴增目的基因的方法。因此本研究首先建立了一套直接從糞便基因組中擴增目的基因的方法,并分析了2型糖尿病患者和健康人的目的基因的差別,同時分析了這種差異所帶來的蛋白功能的不同。首先建立了本地引物比對數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫包含了2017年6月之前NCBI數(shù)據(jù)庫中包含的所有細菌基因的測序數(shù)據(jù)。我們以此數(shù)據(jù)庫做為檢驗所設計引物的特異性的比對數(shù)據(jù)庫,引物設計選用NCBI-PRIMER在線引物設計軟件,要求所設計的引物必須針對目的基因完全特異,使用BLAST工具篩選只能和目的基因匹配的引物。其次選擇PCR(Polymerase Chain Reaction)擴增方法,由于腸道宏基因組數(shù)量非常龐大,而且菌種序列相似性很高,通過一次PCR的方式從腸道宏基因組中直接擴增目的基因存在很大的困難,因此選用巢氏PCR對目的基因做了擴增。擴增產(chǎn)物進行Sanger測序,對測序結果進行進化樹分析和突變位點統(tǒng)計,并做氨基酸注釋。進化樹分析結果發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者和健康人群中腸道微生物B.coprocola的EDU99824.1存在顯著差異,進一步統(tǒng)計突變位點發(fā)現(xiàn)健康人中的EDU99824.1基因主要是野生型或第879位堿基由A變?yōu)镚,而2型糖尿病患者的EDU99824.1基因第880位堿基由C變?yōu)門。進一步對堿基突變結果做了氨基酸注釋后發(fā)現(xiàn),健康人中的第879位突變屬于同義突變編碼谷氨酸,2型糖尿病患者的第880位突變屬于錯義突變,編碼的氨基酸(第294位氨基酸)由脯氨酸變?yōu)榻z氨酸。在分析基因序列時我們發(fā)現(xiàn),健康人和2型糖尿病患者中B.coprocola在第879位和第880位的多克隆株同時存在,即在某一個樣本中野生型和突變株同時存在。為了進一步研究基因突變對EDU99824.1編碼蛋白的功能的影響,我們針對EDU99824.1基因所編碼的糖苷酶做了體外活性檢測實驗。首先構建原核表達載體,將EDU99824.1基因的野生型和突變株連接到質(zhì)粒載體中,然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中進行表達,最后使用純化柱純化目的蛋白,Western blot結果顯示順利純化出目的蛋白。使用對硝基苯-β-D-葡萄糖苷(pNPG)和京尼平苷作為底物檢測EDU99824.1糖苷酶的活性,酶活性檢測結果顯示純化出的蛋白對兩個底物均有活性,野生型和第879位突變株對pNPG的活性沒有統(tǒng)計學差異,而第880位突變株對pNPG的酶活性遠高于野生型和第879位突變株。以京尼平苷為底物檢測酶活性發(fā)現(xiàn)三種突變株對京尼平苷的酶活性按野生型、第879位突變株和第880位突變株的順序依次升高。該結果顯示2型糖尿病患者中的B.coprocola的EDU99824.1糖苷酶相比于健康人能產(chǎn)生更多的葡萄糖,我們猜測這種突變可能參與了2型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展。為了深入分析基因突變給酶活性帶來影響的原因,我們在Expasy SWISS-MODEL服務器上做了蛋白三維結構模擬。模擬結果發(fā)現(xiàn)第294位氨基酸位于蛋白三維結構的最外圍,推測氨基酸由非極性脯氨酸變?yōu)闃O性絲氨酸可能增加了酶對底物的親和性,進而增加了酶活性。我們的研究工作在宏基因組領域首次揭示腸道微生物B.coprocola的EDU99824.1基因的單核苷酸突變與2型糖尿病有關,并發(fā)現(xiàn)這種突變改變了糖苷酶的活性,同時首次發(fā)現(xiàn)B.coprocola在人群中的多克隆現(xiàn)象。上述結論從基因?qū)用娼沂玖四c道微生物與疾病的關聯(lián)關系,為宏基因組研究提供了新的視角。
【圖文】：

數(shù)據(jù)庫作為檢驗設計引物特異性的比對數(shù)據(jù)庫。其次為了減少背景量讓引物特異地找到目的模板，選擇巢氏 PCR 作為擴增方式。引物設計軟件選用 NCBBLAST-Primer 在線設計，一次 PCR 引物不做特異性檢驗，產(chǎn)物作為二次 PCR 引物設計的模板，二次 PCR 為特異性引物，在數(shù)據(jù)庫中只能唯一匹配目的模板。PCR產(chǎn)物進行 Sanger 測序。為了增加測序產(chǎn)物的長度，我們對固定區(qū)段設計了兩對引物做測序結果拼接。測序結果分析分兩個步驟，首先是進化樹分析，從統(tǒng)計學上尋找 2 型糖尿病患者和健康人 EDU99824.1 基因的差異，其次統(tǒng)計所有樣本中突變堿基的位置和類型，并做氨基酸注釋，推測突變對功能可能造成的影響。為了進一步研究這種突變對功能的改變，我們構建了一個含有目的基因的原核表達載體并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，通過擴大培養(yǎng)表達 EDU99824.1 糖苷酶。表達的糖苷酶純化后做體外活性試驗，，以研究 2 型糖尿病患者和健康人中 EDU99824.1 基因的差異在其表達糖苷酶功能上有何不同。為了推測功能差異可能的原因，我們通過蛋白質(zhì)三維結構模擬來預測野生型和突變株在結構上的不同。以下是整個工作的研究路線流程圖：

圖 3.1 EDU99824.1 進化樹分析和突變位點分析3.3 點突變與 2 型糖尿病的關系與多克隆現(xiàn)象3.3.1 點突變與 2 型糖尿病的關系為了進一步探究 879 位點和 880 位點突變與 2 型糖尿病的關系，我們對突變位點翻譯的氨基酸做了分析，如圖 3.2 所示。A 圖依次是沒有發(fā)生突變的野生型，第 879 位堿基發(fā)生突變和第 880 位堿基發(fā)生突變的樣本 Sanger 測序峰圖，以及對應的堿基序列和翻譯出來的氨基酸序列，我們發(fā)現(xiàn)了一個有趣的現(xiàn)象，以健康人為主的 879 位點的突變是由 A 變?yōu)榱?G，對應氨基酸為第 293 位氨基酸沒有發(fā)生變化屬于同義突變，而以 2 型糖尿病患者為主的 880 位點的突變是由 C 變?yōu)榱?T，對應氨基酸為第 294 位氨基酸由非極性的脯氨酸變?yōu)榱藰O性的絲氨酸，屬于錯義突變。B 圖是發(fā)生相應突變類型的樣本數(shù)，并對三種突變類型做了兩兩 OR（Oddsratio）計算，計算結果發(fā)現(xiàn)三個 OR 值都有顯著差異，說明野生型和兩種突變類型都與 2 型糖尿病有關，其中野生型和第 880 位突變株之間的 OR 值最大為 5.53，
【學位授予單位】：軍事科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R587.1

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