【摘要】：第一部分小檗堿抑制高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠脂肪組織纖維化的作用及其機(jī)制目的探討低、中、高劑量的小檗堿對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠脂肪組織纖維化的影響及其作用機(jī)制。方法采用60%高脂飼料喂養(yǎng)雄性C57BL/6小鼠16周,建立肥胖小鼠動物模型,并隨機(jī)分為高脂飲食組、小檗堿低、中、高劑量組,其中低、中、高三個(gè)治療組分別用100mg/kg體重、200 mg/kg體重、300 mg/kg體重劑量的小檗堿連續(xù)灌胃8周,另設(shè)普通飲食的正常對照組。比較各組小鼠體重、空腹血糖、GTT、ITT等差異。H(5)E染色觀察小鼠附睪白色脂肪組織形態(tài)學(xué)改變;Masson’s Trichrome染色和Sirius Red染色檢測附睪白色脂肪組織膠原蛋白沉積的變化;RT-qPCR檢測附睪白色脂肪組織中細(xì)胞外基質(zhì)組分Collegen I、Fibronection、α-SMA的基因轉(zhuǎn)錄水平;Western blot檢測附睪白色脂肪組織中Collegen I、α-SMA、PDGFR-α的蛋白表達(dá)水平。用免疫組織化學(xué)的方法檢測附睪白色脂肪組織中Fibronection、α-SMA的表達(dá)水平。Western blot檢測附睪白色脂肪組織中缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α的蛋白表達(dá)水平,RT-qPCR檢測附睪白色脂肪組織中LOX的基因轉(zhuǎn)錄水平。Western blot檢測附睪白色脂肪組織中凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase3的蛋白表達(dá)水平。用免疫組化的方法檢測附睪白色脂肪組織中cleaved caspase3的表達(dá)水平。結(jié)果小檗堿呈劑量依耐性減輕高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠體重增加(p(27)0.01),增加葡萄糖清除率(p(27)0.05),改善胰島素敏感性(p(27)0.05,p(27)0.01)。與普通飲食組相比,HFD組小鼠附睪白色脂肪組織細(xì)胞大小顯著增加(p(27)0.01)。而BBR治療減小了附睪脂肪組織的細(xì)胞大小(p(27)0.05,p(27)0.01)。Masson’s Trichrome染色和Sirius Red染色顯示HFD組小鼠附睪白色脂肪細(xì)胞簇被束狀和繩狀膠原分割,膠原蛋白沉積增多。經(jīng)BBR中、高劑量組處理后,膠原蛋白沉積明顯減少(p(27)0.05)。與普通飲食組小鼠相比,HFD組小鼠附睪脂肪組織中細(xì)胞外基質(zhì)組分Collegen I、Fibronection、平滑肌肌動蛋白α-SMA的基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)(p(27)0.05,p(27)0.01)。然而,BBR抑制了這些基因的轉(zhuǎn)錄(p(27)0.05,p(27)0.01)。與普通飲食組小鼠相比,HFD組小鼠Collegen I、α-SMA、PDGFR-α、Fibronection蛋白表達(dá)增強(qiáng)(p(27)0.01),而BBR處理可抑制這些蛋白表達(dá)(p(27)0.05,p(27)0.01)。與普通飲食組小鼠相比,HFD組小鼠的附睪脂肪組織中的HIF-1α表達(dá)增多(p(27)0.01),BBR治療抑制了小鼠eWAT中的HIF-1α表達(dá)(p(27)0.05,p(27)0.01)。與普通飲食組小鼠相比,作為HIF-1α的重要靶基因,HFD組小鼠的附睪脂肪組織中催化膠原蛋白修飾和交聯(lián)的賴氨酰氧化酶(LOX)基因的轉(zhuǎn)錄水平增強(qiáng)(p(27)0.01),而BBR可降低LOX的基因轉(zhuǎn)錄(p(27)0.05,p(27)0.01)。此外,BBR尤其是高劑量組干預(yù)后減弱了HFD誘導(dǎo)的附睪脂肪組織中cleaved caspase-3的表達(dá)(p(27)0.05)。結(jié)論黃連有效成分小檗堿能調(diào)節(jié)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠代謝紊亂;減少高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠附睪白色脂肪組織膠原沉積和細(xì)胞外基質(zhì)成分的分泌,抑制脂肪組織纖維化,其機(jī)制可能與抑制白色脂肪組織中HIF-1α激活有關(guān)。第二部分小檗堿抑制腸道脂質(zhì)吸收改善高脂血癥的作用及其機(jī)制目的探討小檗堿對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖動物模型和油酸誘導(dǎo)的Caco-2和FHs 74Int腸上皮細(xì)胞脂肪酸吸收模型對脂質(zhì)吸收的影響及其作用機(jī)制。方法采用60%高脂飼料喂養(yǎng)雄性C57BL/6小鼠16周,建立肥胖小鼠動物模型,并隨機(jī)分為高脂飲食組及小檗堿低、高劑量組,另設(shè)普通飲食的正常對照組。其中低、高兩個(gè)治療組分別用150mg/kg體重、300 mg/kg體重劑量的小檗堿連續(xù)灌胃8周。藥物干預(yù)過程中記錄小鼠體重及進(jìn)食量。分別行GTT、ITT和血脂指標(biāo)檢測評估小鼠的糖脂代謝變化。HE染色觀察小鼠肝臟形態(tài)學(xué)變化,油紅O染色觀察肝臟脂肪沉積情況。HE染色觀察小鼠附睪白色脂肪組織形態(tài)學(xué)變化,免疫組化法檢測小鼠附睪白色脂肪組織巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物F4/80的表達(dá)水平。HE染色觀察近端小腸形態(tài)學(xué)變化,油紅O染色檢測橄欖油灌胃30min后近端小腸脂質(zhì)沉積情況。Western blot檢測近端小腸組織中CD36、FATP4、m TOR、NPC1L1、Numb的蛋白表達(dá)水平。用油酸和BBR聯(lián)合干預(yù)Caco-2細(xì)胞,先用10μM、20μM、30μM小檗堿預(yù)處理Caco-2細(xì)胞,30min后加100m M油酸干預(yù)24h。然后用BODIPY染色檢測Caco-2細(xì)胞脂肪酸吸收情況。Western blot檢測CD36、FATP4的蛋白表達(dá)水平。用油酸和BBR或雷帕霉素(m TOR抑制劑)聯(lián)合干預(yù)FHs 74Int細(xì)胞,先用10μM、20μM、30μM小檗堿或50n M雷帕霉素預(yù)處理FHs 74Int細(xì)胞,30min后加100m M油酸干預(yù)24h。然后用BODIPY染色檢測FHs 74Int細(xì)胞脂肪酸吸收情況。Western blot檢測m TOR、CD36、FATP4的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果體重和攝食結(jié)果提示小檗堿能抑制高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠體重增加且不影響小鼠攝食量。GTT和ITT結(jié)果提示小檗堿能改善肥胖小鼠的糖耐量異常和胰島素抵抗。與普通飲食組小鼠相比,高脂飲食組小鼠附睪白色脂肪細(xì)胞體積增大,炎癥浸潤增多,肝臟脂肪沉積增加,而小檗堿可明顯改善這些外周組織的代謝紊亂。小鼠近端小腸的長度和組織形態(tài)在各組間無顯著差異,而與普通飲食組相比,高脂飲食組小鼠近端小腸脂質(zhì)沉積增多,BBR可明顯改善近端小腸脂質(zhì)沉積。與高脂飲食組小鼠相比,BBR可增加糞便甘油三酯的排泄(p(27)0.01)。與普通飲食組小鼠相比,高脂飲食組小鼠近端小腸脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白CD36、FATP4、m TOR、NPC1LL1、Numb表達(dá)顯著增加,而小檗堿治療組以上蛋白的表達(dá)明顯降低(p(27)0.05,p(27)0.01)。油酸干預(yù)的Caco-2細(xì)胞和FHs 74Int細(xì)胞中脂質(zhì)沉積明顯,小檗堿可抑制上述細(xì)胞中脂質(zhì)沉積。與對照組相比,油酸干預(yù)組Caco-2細(xì)胞和FHs 74Int細(xì)胞中脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白CD36、FATP4表達(dá)增加(p(27)0.01),而小檗堿可抑制這些蛋白的表達(dá)(p(27)0.01),且在FHs 74Int細(xì)胞中雷帕霉素可抑制CD36、FATP4蛋白表達(dá)(p(27)0.01)。結(jié)論小檗堿可有效降低高脂誘導(dǎo)的肥胖動物模型中腸道脂質(zhì)吸收,增加糞便甘油三酯排泄,從而降低血脂水平,并可下調(diào)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白NPC1L1和Numb的表達(dá),同時(shí)下調(diào)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白CD36、FATP4及m TOR的表達(dá)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)小檗堿抑制腸上皮細(xì)胞脂肪酸吸收,降低脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CD36、FATP4的表達(dá),而小檗堿調(diào)控m TOR的表達(dá)可能是其作用機(jī)制之一。
【圖文】：

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文抗為了檢測 BBR 能否改善 HFD 誘導(dǎo)的代謝紊亂，，7 周齡雄性 C57BL/6J 小鼠給予HFD 16 周，然后再給予 BBR 干預(yù) 8 周。與 HFD 組小鼠相比，BBR 顯著降低小鼠體重增加（圖 1-1A）。HFD 顯著增加了小鼠空腹血糖水平，而 BBR 治療有效降低了 HFD誘導(dǎo)的血糖升高（圖 1-1 B）。此外，葡萄糖耐量試驗(yàn)和胰島素耐量試驗(yàn)表明，BBR處理的小鼠葡萄糖清除率增加（圖 1-1 C），胰島素敏感性提高（圖 1-1 E）。我們還計(jì)算了 GTT（圖 1-1D）和 ITT（圖 1-1F）曲線下的面積（AUC），這些結(jié)果表明，BBR治療顯著改善了葡萄糖耐受性和胰島素敏感性。

圖 1-2 小檗堿對 HFD 誘導(dǎo)的肥胖小鼠的 eWAT 纖維化的影響注：A, 附睪脂肪切片 H＆E 染色的組織學(xué)分析。B, 脂肪細(xì)胞面積統(tǒng)計(jì)圖，通過 ImagePro Plus 軟件分析脂肪細(xì)胞面積。C 和 E 分別為 Masson 三色染色和 Sirius Red 染色反應(yīng)附睪白色脂肪組織中膠原的沉積。D 和 F 分別為 Masson 三色染色和 Sirius Red 染色陽性區(qū)域統(tǒng)計(jì)圖（n = 4）。數(shù)據(jù)顯示為 X±SEM。與正常飼料（NC）組相比，**p <0.01;與高脂肪飲食（HFD）組相比，＃P <0.05，##P <0.01。3. BBR 抑制 HFD 小鼠 ECM 蛋白異常合成BBR 減少膠原沉積可能通過調(diào)節(jié) ECM 蛋白的合成和分泌。RT-qPCR 結(jié)果顯示，與普通飲食組小鼠相比，HFD 組小鼠 eWAT 中膠原蛋白 I（Collegen I）、纖維連接蛋白（Fibronection）、平滑肌肌動蛋白（ -SMA）的基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)。然而，BBR 抑制了這些基因的轉(zhuǎn)錄（圖 1-3A，B，C）。用 Western blot 檢測 Collegen I、 -SMA、PDGFR-
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R589.2

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本文編號：2615517