【摘要】：第一部分小檗堿抑制高脂飲食誘導的肥胖小鼠脂肪組織纖維化的作用及其機制目的探討低、中、高劑量的小檗堿對高脂飲食誘導的肥胖小鼠脂肪組織纖維化的影響及其作用機制。方法采用60%高脂飼料喂養(yǎng)雄性C57BL/6小鼠16周,建立肥胖小鼠動物模型,并隨機分為高脂飲食組、小檗堿低、中、高劑量組,其中低、中、高三個治療組分別用100mg/kg體重、200 mg/kg體重、300 mg/kg體重劑量的小檗堿連續(xù)灌胃8周,另設普通飲食的正常對照組。比較各組小鼠體重、空腹血糖、GTT、ITT等差異。H(5)E染色觀察小鼠附睪白色脂肪組織形態(tài)學改變;Masson’s Trichrome染色和Sirius Red染色檢測附睪白色脂肪組織膠原蛋白沉積的變化;RT-qPCR檢測附睪白色脂肪組織中細胞外基質組分Collegen I、Fibronection、α-SMA的基因轉錄水平;Western blot檢測附睪白色脂肪組織中Collegen I、α-SMA、PDGFR-α的蛋白表達水平。用免疫組織化學的方法檢測附睪白色脂肪組織中Fibronection、α-SMA的表達水平。Western blot檢測附睪白色脂肪組織中缺氧誘導因子HIF-1α的蛋白表達水平,RT-qPCR檢測附睪白色脂肪組織中LOX的基因轉錄水平。Western blot檢測附睪白色脂肪組織中凋亡相關蛋白cleaved caspase3的蛋白表達水平。用免疫組化的方法檢測附睪白色脂肪組織中cleaved caspase3的表達水平。結果小檗堿呈劑量依耐性減輕高脂飲食誘導的小鼠體重增加(p(27)0.01),增加葡萄糖清除率(p(27)0.05),改善胰島素敏感性(p(27)0.05,p(27)0.01)。與普通飲食組相比,HFD組小鼠附睪白色脂肪組織細胞大小顯著增加(p(27)0.01)。而BBR治療減小了附睪脂肪組織的細胞大小(p(27)0.05,p(27)0.01)。Masson’s Trichrome染色和Sirius Red染色顯示HFD組小鼠附睪白色脂肪細胞簇被束狀和繩狀膠原分割,膠原蛋白沉積增多。經BBR中、高劑量組處理后,膠原蛋白沉積明顯減少(p(27)0.05)。與普通飲食組小鼠相比,HFD組小鼠附睪脂肪組織中細胞外基質組分Collegen I、Fibronection、平滑肌肌動蛋白α-SMA的基因轉錄增強(p(27)0.05,p(27)0.01)。然而,BBR抑制了這些基因的轉錄(p(27)0.05,p(27)0.01)。與普通飲食組小鼠相比,HFD組小鼠Collegen I、α-SMA、PDGFR-α、Fibronection蛋白表達增強(p(27)0.01),而BBR處理可抑制這些蛋白表達(p(27)0.05,p(27)0.01)。與普通飲食組小鼠相比,HFD組小鼠的附睪脂肪組織中的HIF-1α表達增多(p(27)0.01),BBR治療抑制了小鼠eWAT中的HIF-1α表達(p(27)0.05,p(27)0.01)。與普通飲食組小鼠相比,作為HIF-1α的重要靶基因,HFD組小鼠的附睪脂肪組織中催化膠原蛋白修飾和交聯(lián)的賴氨酰氧化酶(LOX)基因的轉錄水平增強(p(27)0.01),而BBR可降低LOX的基因轉錄(p(27)0.05,p(27)0.01)。此外,BBR尤其是高劑量組干預后減弱了HFD誘導的附睪脂肪組織中cleaved caspase-3的表達(p(27)0.05)。結論黃連有效成分小檗堿能調節(jié)高脂飲食誘導的肥胖小鼠代謝紊亂;減少高脂飲食誘導的肥胖小鼠附睪白色脂肪組織膠原沉積和細胞外基質成分的分泌,抑制脂肪組織纖維化,其機制可能與抑制白色脂肪組織中HIF-1α激活有關。第二部分小檗堿抑制腸道脂質吸收改善高脂血癥的作用及其機制目的探討小檗堿對高脂飲食誘導的肥胖動物模型和油酸誘導的Caco-2和FHs 74Int腸上皮細胞脂肪酸吸收模型對脂質吸收的影響及其作用機制。方法采用60%高脂飼料喂養(yǎng)雄性C57BL/6小鼠16周,建立肥胖小鼠動物模型,并隨機分為高脂飲食組及小檗堿低、高劑量組,另設普通飲食的正常對照組。其中低、高兩個治療組分別用150mg/kg體重、300 mg/kg體重劑量的小檗堿連續(xù)灌胃8周。藥物干預過程中記錄小鼠體重及進食量。分別行GTT、ITT和血脂指標檢測評估小鼠的糖脂代謝變化。HE染色觀察小鼠肝臟形態(tài)學變化,油紅O染色觀察肝臟脂肪沉積情況。HE染色觀察小鼠附睪白色脂肪組織形態(tài)學變化,免疫組化法檢測小鼠附睪白色脂肪組織巨噬細胞表面標志物F4/80的表達水平。HE染色觀察近端小腸形態(tài)學變化,油紅O染色檢測橄欖油灌胃30min后近端小腸脂質沉積情況。Western blot檢測近端小腸組織中CD36、FATP4、m TOR、NPC1L1、Numb的蛋白表達水平。用油酸和BBR聯(lián)合干預Caco-2細胞,先用10μM、20μM、30μM小檗堿預處理Caco-2細胞,30min后加100m M油酸干預24h。然后用BODIPY染色檢測Caco-2細胞脂肪酸吸收情況。Western blot檢測CD36、FATP4的蛋白表達水平。用油酸和BBR或雷帕霉素(m TOR抑制劑)聯(lián)合干預FHs 74Int細胞,先用10μM、20μM、30μM小檗堿或50n M雷帕霉素預處理FHs 74Int細胞,30min后加100m M油酸干預24h。然后用BODIPY染色檢測FHs 74Int細胞脂肪酸吸收情況。Western blot檢測m TOR、CD36、FATP4的蛋白表達水平。結果體重和攝食結果提示小檗堿能抑制高脂飲食誘導的肥胖小鼠體重增加且不影響小鼠攝食量。GTT和ITT結果提示小檗堿能改善肥胖小鼠的糖耐量異常和胰島素抵抗。與普通飲食組小鼠相比,高脂飲食組小鼠附睪白色脂肪細胞體積增大,炎癥浸潤增多,肝臟脂肪沉積增加,而小檗堿可明顯改善這些外周組織的代謝紊亂。小鼠近端小腸的長度和組織形態(tài)在各組間無顯著差異,而與普通飲食組相比,高脂飲食組小鼠近端小腸脂質沉積增多,BBR可明顯改善近端小腸脂質沉積。與高脂飲食組小鼠相比,BBR可增加糞便甘油三酯的排泄(p(27)0.01)。與普通飲食組小鼠相比,高脂飲食組小鼠近端小腸脂質轉運相關蛋白CD36、FATP4、m TOR、NPC1LL1、Numb表達顯著增加,而小檗堿治療組以上蛋白的表達明顯降低(p(27)0.05,p(27)0.01)。油酸干預的Caco-2細胞和FHs 74Int細胞中脂質沉積明顯,小檗堿可抑制上述細胞中脂質沉積。與對照組相比,油酸干預組Caco-2細胞和FHs 74Int細胞中脂肪酸轉運相關蛋白CD36、FATP4表達增加(p(27)0.01),而小檗堿可抑制這些蛋白的表達(p(27)0.01),且在FHs 74Int細胞中雷帕霉素可抑制CD36、FATP4蛋白表達(p(27)0.01)。結論小檗堿可有效降低高脂誘導的肥胖動物模型中腸道脂質吸收,增加糞便甘油三酯排泄,從而降低血脂水平,并可下調膽固醇轉運相關蛋白NPC1L1和Numb的表達,同時下調脂肪酸轉運相關蛋白CD36、FATP4及m TOR的表達。細胞實驗進一步證實小檗堿抑制腸上皮細胞脂肪酸吸收,降低脂肪酸轉運蛋白CD36、FATP4的表達,而小檗堿調控m TOR的表達可能是其作用機制之一。
【圖文】：

華 中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 文抗為了檢測 BBR 能否改善 HFD 誘導的代謝紊亂，，7 周齡雄性 C57BL/6J 小鼠給予HFD 16 周，然后再給予 BBR 干預 8 周。與 HFD 組小鼠相比，BBR 顯著降低小鼠體重增加（圖 1-1A）。HFD 顯著增加了小鼠空腹血糖水平，而 BBR 治療有效降低了 HFD誘導的血糖升高（圖 1-1 B）。此外，葡萄糖耐量試驗和胰島素耐量試驗表明，BBR處理的小鼠葡萄糖清除率增加（圖 1-1 C），胰島素敏感性提高（圖 1-1 E）。我們還計算了 GTT（圖 1-1D）和 ITT（圖 1-1F）曲線下的面積（AUC），這些結果表明，BBR治療顯著改善了葡萄糖耐受性和胰島素敏感性。

圖 1-2 小檗堿對 HFD 誘導的肥胖小鼠的 eWAT 纖維化的影響注：A, 附睪脂肪切片 H＆E 染色的組織學分析。B, 脂肪細胞面積統(tǒng)計圖，通過 ImagePro Plus 軟件分析脂肪細胞面積。C 和 E 分別為 Masson 三色染色和 Sirius Red 染色反應附睪白色脂肪組織中膠原的沉積。D 和 F 分別為 Masson 三色染色和 Sirius Red 染色陽性區(qū)域統(tǒng)計圖（n = 4）。數(shù)據(jù)顯示為 X±SEM。與正常飼料（NC）組相比，**p <0.01;與高脂肪飲食（HFD）組相比，＃P <0.05，##P <0.01。3. BBR 抑制 HFD 小鼠 ECM 蛋白異常合成BBR 減少膠原沉積可能通過調節(jié) ECM 蛋白的合成和分泌。RT-qPCR 結果顯示，與普通飲食組小鼠相比，HFD 組小鼠 eWAT 中膠原蛋白 I（Collegen I）、纖維連接蛋白（Fibronection）、平滑肌肌動蛋白（ -SMA）的基因轉錄增強。然而，BBR 抑制了這些基因的轉錄（圖 1-3A，B，C）。用 Western blot 檢測 Collegen I、 -SMA、PDGFR-
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R589.2

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本文編號：2615517