【摘要】：目的:分析總結(jié)3例遺傳性凝血因子XⅢ缺陷癥患者的臨床與實驗室特征,明確基因突變位點,并通過定點誘變及體外真核表達(dá)系統(tǒng)探討凝血因子XⅢ缺陷的分子機制。方法:1.FXⅢ熒光檢測試劑盒檢測患者血漿中FXⅢ的活性。2.ELISA和Western blot檢測患者血漿中FXⅢA2B2,FXⅢ-A,FXⅢ-B的蛋白水平。3.PCR擴增FXⅢ-A基因外顯子及其側(cè)翼序列并測序分析基因突變位點。4.采用定點誘變技術(shù)構(gòu)建突變型FXⅢ-A質(zhì)粒。5.培養(yǎng)COS7細(xì)胞,瞬時轉(zhuǎn)染野生型和突變型FXⅢ-A質(zhì)粒,RT-PCR檢測FXⅢ-A的m RNA含量,同時Western blot檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞上清及細(xì)胞裂解液內(nèi)FXⅢ-A的蛋白表達(dá)水平。6.共聚焦顯微鏡檢測野生型與突變型的FXⅢ-A在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的亞細(xì)胞定位,分析不同突變體的共定位及Pearson's相關(guān)系數(shù)。結(jié)果:1.FXⅢ熒光檢測結(jié)果顯示隨著反應(yīng)的進(jìn)行正常人反應(yīng)體系的熒光強度逐漸升高,而FXⅢ缺陷患者的反應(yīng)體系中熒光強度上升不明顯甚至恒定,表明患者血漿中FXⅢ活性比正常人明顯降低。2.ELISA檢測發(fā)現(xiàn)與正常人相比,FXⅢ缺陷患者中FXⅢA2B2抗原下降。Western blot檢測結(jié)果表明FXⅢ缺陷患者中FXⅢ-B抗原表達(dá)與正常人相比無差異,而FXⅢ-A抗原相比正常人均有明顯下降,診斷缺陷類型為I型FXⅢ-A缺陷。3.PCR檢測到3例患者分別存在突變位點,患者1:c.G688C,c.A2273G分別導(dǎo)致W188C,H374R。患者2:c.A1798C,c.del723-6 AGAA分別導(dǎo)致T559P,R202Fs 206 ter�；颊�3:c.T1944C導(dǎo)致H717R。4.分別采用定點誘變與大引物方法構(gòu)建四個錯義突變質(zhì)粒(W188C,H374R,T559P,H717R),DNA測序驗證突變載體構(gòu)建成功。5.RT-PCR檢測突變體FXⅢ-A的m RNA表達(dá)水平與野生型無差異,Western blot檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞裂解液中野生型與突變型均表達(dá)FXⅢ-A蛋白,但有不同程度的降低,而濃縮上清中只有野生型表達(dá)FXⅢ-A蛋白,突變體均不表達(dá)FXⅢ-A。6.共聚焦顯微鏡檢測證實突變型FXⅢ-A可在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表達(dá),而高爾基體無表達(dá),提示突變蛋白可正常合成但滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不能運輸?shù)礁郀柣w向細(xì)胞外分泌。結(jié)論:1.該3例凝血因子XⅢ缺陷癥是由于FXⅢ-A基因W188C,H374R,T559P,H717R及R202 Fs 206 ter突變所致,引起血漿中凝血因子FXⅢ-A蛋白含量減少。2:FXⅢ-A基因W188C,H374R,T559P,H717R突變后導(dǎo)致FXⅢ-A蛋白能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常合成,不能進(jìn)入高爾基體加工,導(dǎo)致細(xì)胞分泌減少引起血漿中FXⅢ-A減少,引起I型凝血因子XⅢ缺陷癥。
【圖文】：

血漿樣品中XIII活性測定

圖 2.分析血漿中的 FXIII 抗原含量：1：正常對照，，2：proband3，3：proban2，4：proband1。（A）FXIIIA2B原表達(dá)的 ELISA 測定，患者中 FXIIIA2B2抗原的水平幾乎均低于正常水平。（
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R596.1

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本文編號：2612989