【摘要】：結(jié)節(jié)病是一種以非干酪樣肉芽腫為主要特征,與Th1/Treg(Regulatory T cell)細胞免疫紊亂緊密相關(guān)的全身性多器官肉芽腫疾病,90%以上的結(jié)節(jié)病患者會累及肺部,因此也被稱為肺結(jié)節(jié)病。肺結(jié)節(jié)病目前尚無針對發(fā)病機制的有效治療手段。第一部分:白介素33改善肺結(jié)節(jié)病中Treg細胞紊亂的研究肺結(jié)節(jié)病患者支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)和外周血中Treg細胞水平異常且功能缺陷。我們對肺結(jié)節(jié)病小鼠模型施用白介素33(Interleukin33,IL33)或抗白介素23(Interleukin23,IL23)抗體進行干預(yù),通過流式細胞術(shù)(FACS)分析或?qū)崟r定量PCR(qPCR)檢測Th1/T helper 17 cell(Th17)/Tregs的平衡情況,以及Treg細胞免疫調(diào)節(jié)能力的變化,以此研究IL33或抗IL23抗體對肺結(jié)節(jié)病免疫紊亂的調(diào)節(jié)和對Treg細胞群穩(wěn)態(tài)的影響。同時通過蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)檢測PI3K/Akt和TGF-β/Smad2/Smad3信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達,尋找此過程中可能發(fā)揮作用的關(guān)鍵信號通路。結(jié)果表明,IL33可以促進肺結(jié)節(jié)病小鼠模型Th1/Th17/Tregs的再平衡,增強結(jié)節(jié)病中受到損傷的Treg細胞的免疫調(diào)節(jié)能力。而IL33的調(diào)節(jié)作用可能是通過促進Treg細胞表面ST2(IL33受體)的過表達來實現(xiàn)的。此外,IL33促進肺結(jié)節(jié)病中Th1/Th17/Tregs再平衡的同時,有效地抑制了在結(jié)節(jié)病中異常活化的PI3K信號通路。結(jié)果提示:IL33可能通過抑制P13K信號通路,恢復(fù)肺結(jié)節(jié)病中Tregs穩(wěn)態(tài),再平衡Th1/Th2,發(fā)揮抗炎作用。PI3K信號通路可能對結(jié)節(jié)病中Treg細胞的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)起到重要作用,因此設(shè)計了后續(xù)實驗,對PI3K通路與結(jié)節(jié)病中Treg細胞之間調(diào)控關(guān)系進行進一步研究。第二部分:調(diào)控PI3K信號通路對肺結(jié)節(jié)病Treg細胞紊亂的研究PI3K/Akt信號通路對于維持Treg的體內(nèi)平衡至關(guān)重要�；顒悠诮Y(jié)節(jié)病患者PI3K/Akt信號通路異常激活。結(jié)合前期數(shù)據(jù),我們選用了兩種PI3K抑制劑(LY294002和BKM120),來調(diào)控PI3K信號通路,以調(diào)節(jié)結(jié)節(jié)病中Treg細胞水平和功能。采用FACS、qPCR和MACS免疫磁珠分選CD4+CD25+T細胞以檢測其抑制功能等方法,檢測PI3K抑制劑對結(jié)節(jié)病小鼠模型Th1/Th2、Treg/Th17細胞亞群紊亂的調(diào)節(jié)作用以及對Treg細胞增殖、分化和功能的影響。結(jié)果顯示,在肺結(jié)節(jié)病模型小鼠的Treg細胞群中存在著PI3K/Akt信號通路的異常活化,同時Treg細胞的抑制功能受損。PI3K抑制劑可有效抑制肺內(nèi)和Treg細胞中PI3K/Akt信號通路的活化,恢復(fù)結(jié)節(jié)病中受損的Treg細胞的免疫抑制功能,再平衡Th1/Treg,控制肺結(jié)節(jié)病的進展。我們的實驗結(jié)果證明了抑制PI3K信號通路,可以有效地恢復(fù)肺結(jié)節(jié)病中Treg細胞的穩(wěn)態(tài)。而BKM120較LY294002的作用效果更加顯著,提示PI3Kp110γ在該調(diào)節(jié)過程中的重要作用。后續(xù)的實驗將深入探尋PI3Kp11Oy在肺結(jié)節(jié)病發(fā)生發(fā)展中的作用,以尋找針對結(jié)節(jié)病發(fā)病機制的特異性藥物。
【圖文】：

Ｔ細胞分別計數(shù)，然后根據(jù)細胞濃將不同比例的細胞到１２孔板，入逡逑完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，７２小時以后收取細胞并分析。逡逑２．１８統(tǒng)計學(xué)處理逡逑米用ＧｒａｐｈＰａｄ邋Ｐｒｉｓｍ邋７．０邋（ＧｒａｐｈＰａｄ邋Ｓｏｆｔｗａｒｅ，邋Ｌａ邋Ｊｏｌｌａ，邋ＣＡ，邋ＵＳＡ）軟件進行數(shù)逡逑據(jù)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤來表示，各組間比較采用完全隨機方法分析逡逑（Ｏｎｅ－ｗａｙ邋ＡＮＯＶＡ），Ｐ邋＜邋０．０５認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。逡逑３．結(jié)果逡逑３．１邋Ｃ５７ＢＬ／６肺結(jié)節(jié)病小鼠模型的建立和鑒定逡逑參照臨床上對結(jié)節(jié)病患者的給藥時間，我們在對小鼠進行第一次敏化的第逡逑４４天（發(fā)病較晚期）給予小鼠ＩＬ３３或抗ＩＬ２３抗體進行干預(yù)（圖１）。具體步驟見逡逑方法部分。逡逑

我們檢測了肺結(jié)節(jié)病小鼠模型ＢＡＬＦ中的Ｔｒｅｇ細胞的數(shù)量和功能的變逡逑化情況．？與正常組比，結(jié)節(jié)病組小鼠的Ｔｒｅｇ細胞的數(shù)量顯著升高，，但是免疫抑逡逑制能力卻大幅下降（圖３）。逡逑Ｉ邋３］邐｜６０１邐．逡逑４０－逡逑卜｜逡逑—0邐＾邐邋Ｉ逡逑Ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ邐Ｃｏｎｔｒｏｌ邋°邐Ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ邐Ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑圖３各組小鼠淋巴結(jié)中的Ｔｒｅｇ細胞的數(shù)量和抑制功能的流式統(tǒng)計結(jié)果（＊Ｐ＜０．０５，逡逑＊＊＊Ｐ＜０．００１．邋ｎ邋＝邋１０）逡逑３．２經(jīng)過藥物干預(yù)以后結(jié)節(jié)病中的Ｔｈｌ和Ｔｒｅｇ的變化逡逑ＩＬ３３可以有效地抑制在結(jié)節(jié)病中出現(xiàn)的Ｔｈｌ細胞群異常增多（１０．０３邋士逡逑３＿６５３邋％邋ｖｓ．邋２８．３８邋±５＿７１４邋％；邋Ｐ邋＜邋０．０１，ｑ邋＝邋４．１３１，ａｎｄ邋Ｐ邋＜０．０１．邋ｑ邋＝邋３．０６７），去Ｐ并不逡逑會改變原來就沒有變化的Ｔｈ２細胞群的水平，抗ＩＬ２３在調(diào)節(jié)Ｔｈｌ型細胞紊亂的表逡逑８３逡逑
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R597

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本文編號：2611719