【摘要】：隨著我國經濟的飛速發(fā)展,我國人民的飲食結構也較前有了巨大的改變,且由于西方國家的飲食習慣的影響,我國近年來對可樂、快餐等高脂高熱量的食物消耗量明顯上升。流行病學資料顯示,非酒精性脂肪肝(non-alcohol fatty liver disease,NAFLD)的發(fā)病率大幅攀升。NAFLD目前已成為多數西方國家的第一大慢性肝臟疾病。NAFLD的病變特點多呈一個連續(xù)發(fā)展的疾病譜,其病變的早期,具有可逆性的特點,如何針對NAFLD的發(fā)病機理進行研究,進而逆轉NAFLD的連續(xù)發(fā)展疾病譜,是目前醫(yī)務工作人員防治代謝性疾病的重點和難點。根據我國2010版非酒精性脂肪性肝病診療指南,NAFLD的患病人群,其肝臟的病理特征為混合性的肝細胞脂肪變,可以伴有或不伴有炎癥細胞的浸潤以及竇周的纖維化,并且NAFLD的患者既往無飲酒史或飲酒折合乙醇量小于140g/周(女性小于70g/周)。NAFLD與胰島素抵抗及遺傳易感性密切相關,NAFLD包括了疾病初期階段的非酒精性單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎,如高危因素持續(xù)存在,病情進展后發(fā)生肝硬化甚至肝細胞癌等一系列肝臟損害。NAFLD的發(fā)生發(fā)展過程中,其重要的病理基礎是胰島素抵抗(insulin resistance,IR),因此,我們需要尋找可供研究的胰島素抵抗或脂質沉積動物模型。在我們課題組的前期基礎研究中證實,利用高脂飲食喂養(yǎng)鼠類,經過一段時間的誘導后,可以觀察到鼠類動物模型出現肝臟胰島素抵抗及脂質沉積,因此,本研究選取高脂誘導的胰島素抵抗模型作為實驗模型。氧化苦參堿(Oxymatrine,OMT)又稱為苦參素,主要是從苦參、山豆根及苦豆子等中藥材中提取而得的一種生物堿。具有利尿、抗感染、降血脂、抗纖維化、抗腫瘤、保護肝細胞及免疫調節(jié)等多種作用。在臨床上主要用于治療慢性肝炎、脂肪肝等肝臟損傷。有研究發(fā)現,氧化苦參堿可改善高果糖誘導的胰島素抵抗,減輕肝臟脂質沉積,但具體作用機制尚不清楚,有待深入研究。成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)是目前研究比較火熱的一類新型生長因子,它們是一個大的家族,目前發(fā)現共有22個成員,它們的生理功能也不僅僅局限于初期發(fā)現的促進細胞增殖、機體發(fā)育及創(chuàng)傷修復等,越來越多的研究發(fā)現一些成纖維細胞生長因子在機體的代謝方面發(fā)揮了重要作用。其中FGF21就是FGF家族中的一個非典型性成員,FGF21主要在肝臟中表達,在骨骼肌、脂肪組織中雖有表達,但非主要表達器官,相關研究表明,FGF21的主要生物學功能是調節(jié)糖脂代謝。臨床研究及相關動物實驗顯示,胰島素抵抗狀態(tài)下,血清FGF21水平可增高,調節(jié)糖原合成和酮體生成,進而調節(jié)胰島素抵抗。相關研究發(fā)現,氧化苦參堿能夠通過調節(jié)FGF21發(fā)揮作用,然而,氧化苦參堿是否通過調節(jié)FGF21進而改善高脂誘導大鼠的肝臟脂質沉積及胰島素抵抗,目前未發(fā)現國內外相關報道。目前有關于2型糖尿病合并脂肪肝患者血漿FGF21的表達水平相關研究,觀察到伴隨機體脂代謝異常及胰島素抵抗的同時,FGF21血漿表達增加。本研究首先對脂耐量異常人群進行觀察,了解甘油三酯水平與FGF21水平相關性,同時觀察FGF21與非酒精性脂肪肝的相關性。進一步通過高脂飲食誘導產生大鼠胰島素抵抗模型,并予以氧化苦參堿干預,觀察肝臟組織胰島素信號通路、脂肪酸代謝通路及FGF21的表達變化。最后通過高脂誘導的肝臟HepG2細胞,在細胞水平求證氧化苦參堿是否通過FGF21改善其胰島素抵抗及脂質沉積,揭示氧化苦參堿改善非酒精性脂肪肝的作用,為尋找非酒精性脂肪肝新的治療靶點提供理論依據。第一部分不同脂質代謝人群血清FGF21水平變化與非酒精性脂肪肝發(fā)生的相關研究目的:比較不同脂質代謝人群脂肪餐前后FGF21水平變化情況,進一步探討FGF21與非酒精性脂肪肝的關系。方法:選取2017年6月至2018年1月在河北省人民醫(yī)院內分泌科參加脂肪餐試驗的志愿者93人。受試者知情同意后,行口服脂肪餐試驗,抽取空腹及餐后4小時靜脈血測定FGF21水平。非酒精性脂肪肝基于超聲診斷,診斷標準參照2010年非酒精性脂肪性肝病診療指南。按空腹甘油三酯及脂肪餐后4小時甘油三酯水平分為三組,分別為脂耐量正常組(normal fat tolerance,NFT)、脂耐量減低組(impaired fat tolerance,IFT)以及高甘油三酯組(hypertriglyceridemia,HTG)。結果:1.脂耐量正常組、脂耐量減低組、高甘油三酯血癥組的BMI比較:與脂耐量正常組比較,脂耐量減低組及高甘油三酯血癥組BMI成上升趨勢,三組間差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.脂耐量正常組、脂耐量減低組、高甘油三酯血癥組的空腹血糖、TC、TG、低密度脂蛋白比較:與脂耐量正常組比較,脂耐量減低組及高甘油三酯血癥組空腹血糖、TC、TG、低密度脂蛋白成上升趨勢,三組間差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.脂耐量正常組、脂耐量減低組、高甘油三酯血癥組非酒精性脂肪肝發(fā)生率比較:三組間非酒精性脂肪肝發(fā)生率逐漸升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。根據血清FGF21四分位法將受試者分為四組,從Q1組到Q4組,與Q4組相比,Q1、Q2、Q3組非酒精性脂肪肝的發(fā)生率逐漸升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.脂耐量正常組、脂耐量減低組、高甘油三酯血癥組空腹FGF21水平與脂肪餐后FGF21水平比較:三組間空腹FGF21水平逐漸升高,脂耐量減低組、高甘油三酯血癥組高于脂耐量正常組,高甘油三酯血癥組高于脂耐量減低組,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05),三組間脂肪餐后4h FGF21水平均升高,三組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),各組空腹FGF21與脂肪餐后4h FGF21水平比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。小結:1.血清FGF21水平與血清甘油三酯水平密切相關,隨著甘油三酯水平的升高,血清FGF21水平逐步升高。2.血清FGF21水平與非酒精性脂肪肝發(fā)生密切相關,隨著血清FGF21水平升高非酒精性脂肪肝發(fā)生增加。第二部分氧化苦參堿對高脂誘導胰島素抵抗大鼠肝臟脂質沉積的影響目的:探討氧化苦參堿對高脂誘導大鼠肝臟脂質沉積的變化以及大鼠胰島素抵抗的影響。方法:8周齡清潔級健康的雄性SD大鼠(180-220g)48只,喂養(yǎng)1周后隨機分為2組:正常對照組(normal diet,ND)12只和高脂飲食組(high fat diet,HFD)36只。普通飼料喂養(yǎng)ND組,高脂飼料喂養(yǎng)HFD組。每組小鼠喂養(yǎng)等熱量飼料,并詳細記錄,水自由攝入,定期測定空腹體重。喂養(yǎng)8周后,ND組及HFD組隨機抽取大鼠,待測大鼠禁食12小時過夜,次晨空腹行腹腔注射葡萄糖耐量試驗(intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT),記錄干預后血糖值變化情況,依據公式得出葡萄糖曲線下面積(area under the curve,AUCglu)。待測大鼠同時行清醒狀態(tài)下高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗,比較不同干預后葡萄糖輸注率(glucose infusion rate,GIR)變化。證實肝臟胰島素抵抗模型是否成立。造模成功后,ND組剩余6只大鼠不變,將HFD組剩余的30只大鼠隨機分為5組:高脂組(HFD)、氧化苦參堿低劑量組(OMT-L)、氧化苦參堿中劑量組(OMT-M)、氧化苦參堿高劑量組(OMT-H)及二甲雙胍組(Met)。OMT-L、OMT-M、OMT-H組分別給予氧化苦參堿50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg灌胃,每日一次。Met組予以二甲雙胍500mg/kg灌胃,每日一次。ND組及HFD組予以生理鹽水2ml/kg灌胃,每日一次。藥物干預10周,每周根據體重值調整給藥劑量。藥物干預10周末,再次行IPGTT及GIR試驗,并計算AUCglu。采集血清標本檢測基礎空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglycerides,TG)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine amino-transferase,ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate amino-transferase,AST)。待測血清空腹胰島素(fasting insulin,FINS)水平及游離脂肪酸(free fat acid,FFA)水平利用酶聯免疫吸附法(Enzyme linked immumosorbent assay,ELISA)檢測。留取血清標本后,處死各組大鼠,留取肝臟組織,制備透射電鏡標本,觀察大鼠肝臟超微結構。結果:1.大鼠適應性喂養(yǎng)1周后基礎值比較:與正常對照組比較,高脂組大鼠體重及每日平均攝食量之間無明顯差異(P0.05)。2.高脂飲食誘導8周后,肝臟胰島素抵抗及脂質沉積模型的構建。1)組大鼠基礎生化指標比較:與對照組相比,高脂組大鼠體重、FBG、ALT、TC、TG、FINS、FFA均升高(P0.05),兩組大鼠血清AST差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。2)兩組大鼠糖耐量結果的比較:IPGTT結果顯示:與對照組比較,高脂飲食組大鼠血糖基礎值及干預后15min、30min、60min及120min血糖均升高(P0.05)。高脂組AUCglu也顯著升高(P0.05)。3)兩組大鼠葡萄糖輸注率的比較:與正常對照組比較,高脂組大鼠GIR明顯降低(P0.05)。4)兩組大鼠肝臟細胞超微結構比較:電鏡下可見正常對照組大鼠肝細胞胞漿內無脂滴,線粒體、內質網豐富,內質網排列整齊,高脂組大鼠肝臟細胞中可見脂滴,線粒體模糊不清或缺失,內質網有融合、模糊不清或脫顆�，F象,提示肝臟細胞脂質沉積。3.藥物干預10周后,指標變化情況1)各組大鼠基礎指標比較:高脂組大鼠體重、FBG、TC、TG、ALT、AST、FINS、FFA均高于正常對照組(P0.05)。氧化苦參堿各組及二甲雙胍組較高脂組降低(P0.05)。2)各組大鼠糖耐量結果比較:IPGTT結果顯示:高脂組大鼠空腹血糖及干預后15min、30min、60min、120min血糖均較對照組升高(P0.05)。氧化苦參堿各組及二甲雙胍組較高脂組降低(P0.05)。高脂組AUCglu高于正常對照組(P0.05)。氧化苦參堿各組及二甲雙胍組AUCglu較高脂組降低(P0.05)。3)各組大鼠葡萄糖輸注率比較:與對照組比較,高脂組GIR明顯降低(P0.05)。氧化苦參堿各組及二甲雙胍組GIR較高脂組升高(P0.05)。4)各組大鼠肝臟細胞超微結構比較:電鏡下可見正常對照組肝細胞胞漿內無脂滴,線粒體、內質網豐富,內質網排列整齊,高脂組肝臟細胞中可見脂滴,線粒體模糊不清或缺失,內質網有融合、模糊不清或脫顆�，F象,均提示肝臟細胞脂質沉積和細胞器損傷。氧化苦參堿干預后高脂+氧化苦參堿各組脂滴較高脂組減少,線粒體腫脹及內質網損失有所減輕。小結:1.高脂飲食能夠誘導大鼠出現肝臟脂質沉積及胰島素抵抗。2.氧化苦參堿能夠改善高脂飲食誘導的肝臟脂質沉積,改善葡萄糖耐量及胰島素抵抗。第三部分氧化苦參堿對高脂誘導大鼠肝臟FGF21表達和胰島素信號通路及線粒體脂肪酸代謝通路的影響目的:通過檢測氧化苦參堿干預后FGF21的mRNA及其蛋白表達,同時觀察胰島素信號通路及脂肪酸代謝通路相關因子表達變化情況,探討FGF21是否參與氧化苦參堿調節(jié)胰島素信號傳導通路及改善線粒體脂肪酸代謝的過程。方法:動物分組及標本采集同第一部分。測定肝臟組織中甘油三酯(Triglyceride,TG)含量。采用RT-PCR檢測肝臟組織FGF21、磷脂酰肌醇-3激酶(Phos-phatidylinositol-3 kinase,PI3K)、胰島素受體底物-1(Insulin receptor substrate 1,IRS-1)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又稱Akt)、葡萄糖轉運蛋白2(glucose transport protein2,GLUT2)的mRNA水平,采用western blot技術檢測肝臟組織FGF21蛋白表達水平,胰島素信號通路p-IRS-1,IRS-1,p-Akt及Akt的表達以及脂肪酸代謝上游因子腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)的磷酸化水平、過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子-1α(peroxisome proliferator-activa-ted receptorγcoactivator 1α,PGC-1α)、脂肪酸轉位酶Transporter fatty acid translocase,FAT/CD36)、肉堿棕櫚酰轉移酶-1(Carnitine palmitoyl transferase-1,CPT1)的蛋白水平。結果:1.各組大鼠肝臟組織FGF21的mRNA基因水平:與對照組相比,高脂組大鼠FGF21mRNA升高(P0.05)。氧化苦參堿各組及二甲雙胍組較高脂組升高(P0.05)。2.各組大鼠肝臟組織FGF21蛋白表達:與對照組相比,高脂組大鼠肝臟組織FGF21蛋白水平升高(P0.05)。氧化苦參堿各組及二甲雙胍組較高脂組升高(P0.05)。3.各組大鼠肝臟組織TG含量的比較。與對照組相比較,高脂組大鼠肝臟TG含量增高(P0.05)。氧化苦參堿各組及二甲雙胍組與高脂組相比,肝臟TG含量降低(P0.05)。4.與對照組相比,高脂組大鼠肝臟PI3K、IRS-1、Akt、GLUT2的mRNA表達水平降低(P0.05)。氧化苦參堿各組及二甲雙胍組與高脂組相比,肝臟PI3K、IRS-1、Akt、GLUT2的mRNA表達水平升高(P0.05)。5.與正常對照組相比,高脂組大鼠肝臟組織中p-IRS-1/IRS-1的比值水平增高,p-AKT/AKT的比值水平降低(P0.05)。氧化苦參堿各組及二甲雙胍組與高脂組相比,肝臟組織中p-IRS-1/IRS-1的比值水平降低,p-AKT/AKT的比值水平增高(P0.05)。6.各組大鼠肝臟AMPK的磷酸化水平、PGC1α、CD36及CPT1的蛋白水平變化比較。與正常對照組相比,高脂組大鼠肝臟組織中p-AMPK水平降低,同時PGC1α及CPT1表達降低,CD36表達升高(P0.05)。氧化苦參堿各組及二甲雙胍組與高脂組相比,肝臟組織中p-AMPK、PGC1α及CPT1的水平回升,CD36表達下降(P0.05)。小結:1.氧化苦參堿能夠提高高脂飲食大鼠肝臟FGF21表達,上調PI3K、IRS-1、Akt、GLUT2表達水平,提示氧化苦參堿能夠調控FGF21/IRS-1/Akt/GLUT2通路,從而改善肝臟胰島素抵抗及糖代謝紊亂。2.氧化苦參堿能夠上調p-AMPK及PGC1,提示氧化苦參堿能夠調控p-AMPK/PGC1通路,加強脂肪酸的氧化過程,從而改善肝臟脂質沉積。第四部分通過調節(jié)FGF21的表達探討氧化苦參堿改善高脂誘導的肝細胞糖脂代謝紊亂的作用機制目的:通過HepG2細胞的胰島素抵抗模型。應用轉染技術靶向干預FGF21的表達,觀察HepG2細胞脂質沉積的變化,探討氧化苦參堿是否通過FGF21/Akt及FGF21/AMPK通路調節(jié)肝細胞中葡萄糖代謝及脂肪酸代謝。方法:在棕櫚酸培養(yǎng)的HepG2細胞中分別轉染針對FGF21的小干擾RNA及過表達FGF21的質粒,具體分為以下六組:正常對照組(N)、棕櫚酸組(Pa)、棕櫚酸+氧化苦參堿組低劑量組(Pa+OMT-L)、棕櫚酸+氧化苦參堿組高劑量(Pa+OMT-H)、棕櫚酸+針對FGF21小干擾RNA組(Pa+S)、棕櫚酸+過表達FGF21質粒組(Pa+P)。測定HepG2細胞中TG的水平以觀察細胞脂質沉積的情況。采用western blot技術檢測FGF21的蛋白表達、胰島素信號通路p-IRS-1、IRS-1、p-Akt、Akt的蛋白表達、脂肪酸氧化通路p-AMPK、AMPK、CPT1、CD36的蛋白表達情況。結果:1.HepG2細胞的胰島素抵抗(IR)模型構建:HepG2細胞培養(yǎng)24小時后,高脂組葡萄糖含量較正常對照組增高,提示高脂誘導胰島素抵抗模型的成功建立。2.靶向干預FGF21對HepG2細胞FGF21表達的影響:在棕櫚酸培養(yǎng)的HepG2細胞中分別轉染針對FGF21的小干擾RNA及過表達FGF21的質粒后,Pa+S組FGF21的蛋白表達較Pa+OMT組降低,Pa+P組FGF21的蛋白表達較高脂組明顯升高(P0.05)。Pa+S與高脂組比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。Pa+P與Pa+OMT組比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。Pa+OMT不同劑量組FGF21的蛋白表達比較,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.靶向干預FGF21對HepG2細胞脂質沉積的影響:高脂組TG比正常對照組升高(P0.05)。Pa+OMT組TG水平較高脂組降低(P0.05)。Pa+S組TG水平較Pa+OMT組升高(P0.05)。Pa+P組TG水平較高脂組降低(P0.05)。Pa+P與Pa+OMT組TG水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.靶向干預FGF21對HepG2細胞胰島素信號通路的影響:高脂組胰島素信號通路p-IRS-1蛋白表達增高,p-Akt的蛋白表達下降,Pa+OMT組p-IRS-1蛋白表達降低,p-Akt的蛋白表達升高(P0.05)。Pa+S組與Pa+OMT相比,p-IRS-1的蛋白表達增高、p-Akt的蛋白表達下降(P0.05),Pa+S與Pa組比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。Pa+P組與高脂組相比,p-IRS-1的蛋白表達下降、p-Akt的蛋白表達增高(P0.05)。Pa+P與Pa+OMT組比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。5.靶向干預FGF21對HepG2細胞脂肪酸代謝通路的影響:高脂組細胞,脂肪酸代謝通路p-AMPK、CPT1的蛋白表達降低、CD36蛋白表達升高。Pa+OMT組p-AMPK、CPT1的蛋白表達升高、CD36蛋白表達降低(P0.05)。Pa+S組與Pa+OMT相比,p-AMPK及CPT1α的蛋白表達降低、CD36蛋白表達升高(P0.05)。Pa+S與高脂組比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。Pa+P組與高脂組相比,p-AMPK及CPT1的蛋白表達增高,CD36蛋白表達降低(P0.05)。Pa+P與Pa+OMT組比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。小結:1.氧化苦參堿可以通過調控胰島素信號通路IRS-1及Akt、脂肪酸代謝通路AMPK及CPT1、CD36的表達改善高脂誘導的HepG2細胞的脂質沉積。2.氧化苦參堿能夠增加FGF21水平,調控FGF21/IRS-1/Akt及FGF21/AMPK/CPT1通路的表達,FGF21是氧化苦參堿改善高脂誘導胰島素抵抗及肝臟糖脂代謝紊亂的關鍵因子。結論:1.高甘油三酯可以使肝臟FGF21分泌入血增加,FGF21的血清水平與非酒精性脂肪肝的發(fā)生密切相關。2.FGF21通過增加葡萄糖利用水平,促進肝臟脂肪酸氧化,進而改善胰島素抵抗及脂質沉積。3.氧化苦參堿通過調節(jié)高脂干預前后FGF21的表達水平,對胰島素信號通路FGF21/Akt/GLUT2及脂肪酸代謝通路FGF21/AMPK/CPT1的表達進行調控,改善高脂誘導的胰島素抵抗及肝臟糖脂代謝紊亂。
【圖文】：

37℃溫育 10 分鐘，，加入終止液 50μl，立即 波長處，以空白孔調零，測定各孔的 OD 值。根據 OD 得值即為血漿濃度。方法據處理采用 SPSS21.0 軟件，結果以均數±標準差表示。驗組用t檢驗比較，非正態(tài)且方差不齊的試驗組應用秩和為差異有統(tǒng)計學意義。結 果耐量正常組、脂耐量減低組、高甘油三酯血癥組的 BMI 常組比較，脂耐量減低組及高甘油三酯血癥組 BMI 成差異有統(tǒng)計學意義（圖 1）（P<0.05）。（表 1）

FT group.All results are presented as mean ± SEM.2. 脂耐量正常組、脂耐量減低組、高甘油三酯血癥組的空腹血糖（圖2A）、TC（圖 2B）、TG（圖 2C）、低密度脂蛋白（圖 2D）比較：與脂耐量正常組比較，脂耐量減低組及高甘油三酯血癥組空腹血糖、TC、TG、低密度脂蛋白成上升趨勢，三組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。（表 2）AB
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R587.2;R575.5

【參考文獻】

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本文編號：2609374